[发明专利]一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法

摘要

本发明公开的是一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法，包括以下步骤：（1）筛选候选序列（2）筛选候选SNP位点（3）设计特异性引物。本发明可以在没有已知的凡纳滨对虾基因组DNA单核苷酸多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，筛选出候选序列及候选SNP位点，为凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记的筛选及检测打下基础，在这个基础上利用生物信息学分析筛选C239T单核苷酸多态性位点；并采用PAMSA（PCR amplification of multiple specific alleles）方法设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

主权项

1.一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法，其特征在于所述方法包括下述具体技术步骤：（1）筛选候选序列提取15尾凡纳滨对虾的头胸甲总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接凡纳滨对虾头胸甲参考转录本，比对定位测序读端（reads）到参考转录本筛查单核苷酸多态性位点，并筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上，以及次要等位基因频率高于20%的位点为候选序列；（2）筛选候选SNP位点其候选comp39413的基因序列为：GTTCGTCGTCGTGAGAACTTCAATCAACTCTATTAGCTAGTAAAATGGCCACCACGTGCTGCCGCCCTCTTGTGGGCGTGTACGAGGCAGGCGCGCCCACAAAGAGCCGCGTGTCCCTGCCAGCGGTGTTCCGAGCCCCAATCAGGCCAGATGTGGTGAACTTCGTGCATGACCAGATGGCCAAGAACACACGCCAACCCTATGCTGTCAACAAGGATGCTGGTCACCAGACTTCAGCCGAGTCTTGGGGTACTGGTCGTGCTGTGGCCCGTATCCCCCGTGTCCGTGGTGGTGGTACTCACCGCTCTGGTCAGGGTGCCTTTGGTAACATGTGCCGTGGTGGTCGTATGTTTGCCCCAACTAAGATCTGGCGCCGCTGGCACCGCCGTGTTGGTGTTAACCAGAAACGTTACGCCATGTGCTCAGCCATTGCTGCCTCAAGCATTCCAGCTCTTGTTATGTCAAAGGGCCACATGATCCAGGAAGTGCCTGAGGTACCCCTGGTTGTTAGCAACAAGGCCCAGGAGCTGACAAAGACCAAGGAGGCTGTTGCTCTCTTGAGACAGCACCATGCCTGGACTGATGTTCTTAAGGTGTACAAGAGCCAGAGGTTCCGTGCTGGTAGGGGTAAGATGCGCAACCGCCGTCGCATCCAGAGGAAGGGACCTCTGGTTATCTACAATAATGACCAGGGCCTGACCAGAGCCTTCCGCAACGTACCTGGTGTTGAGACCATCTGTGTTGACAAGCTGAATCTGCTGAAGCTTGCTCCTGGTGGCCATGTGGGAAGATTCTGTATCTGGACTGAGGATGCATTCCGTAAGTTGGATGCTCTCTATGGAACATGGCGCAAGGAGGCTAAGAACAAGAAGGGATATAATCTACCGGTGTCAAAAATGACCAACACCGATTTGTCCAGGCTCCTGAAGTCAGATGAAATCAAGTCTGTCATTAGGAAGCCAAACAAGACCATTGTTCGTAGCAAGGTGAAGCCAAACCCACTGACCAACTACCAAGCCATGCTGGAACTTAACCCCTTCCACCGTGTTGAGAAGAAATTGGCCCAAGCTGTTGAAGCAAAGCACATCGAGGCTAAGAAGTCCGGAAAGCCTAAGGTTGTAAAGCCTGCAAAGAAAGAAAAGCAAAGAAAGAAGAAGACTACCAAGAAGACTGTGAAGAGGCTGAGGAAGCAGCACCCAAGGAGCCATTCTGGCAAGAAGGGCAAGGCTGCTGCAAAGTAAAGCAAACCAGGCAATGCTTTGGTAAAAAATAAACCGTGCAAGAAACTTTTGTTTTCTTTATCCGAAATTTAATATTGAATTTGAATTCCCTGTAGATCATACTCAACTTTGGGTAAGTATTTTGAGTATACAATTTTTTATTTTCTGCAGCAATTTAGTACAGAAGGCTTCTCCTTGGGTTGGTTTAGTTGTCTTTTTAGTACTTGAGGTAAGAATTCTCAATCTTAACCATTCCTGCTGGGTAAAAAGTTTGGCAAGTGGATGTATTAATAATAGGCACCTAATTTCATAGAACTCAATAAGAAACCGTACCCCAAAAGACTTGACACAATTATTAAAAATTGTTAGTAATATTCTTTTAAAGCAGTCAAATGTAATGTTTAGTCACTCAATTTTCCTTGCATAGTCTACATCCAGATTGGTTTCAAAATTGGTAGATGTGCACTTAGACAAGTTTTGTTGACAACCTAATTTTATTTGCATTTAAATTCAAGGAATGGTAGGTCTTTTATTTACATGTAATATATTGAGTGCACCTTTTTTAAGTGTCATTTCCCAGGTTTCGTGGCAAATAAATTTTGAACAAGTACTTGCATCTTGCCCTACAGCTAGGTACTGGTCCAAGAATAAATGTTAACCTTTTCTTTTCAGGTGTCCTGTAGCCAAAGTTTAAGCATATAATAATGACGTAACGTTTGCCCGAATGCTTGGTGCAGTGTTGAAAATCCTCCACTTTAGAATAGAATGAAGGTACAAGGTGGCATCAAGTGACATGATTTGGTGATCTATCAAAGTGAATCTTGCAGAATCGAGAAATGTTCAAGCCCAATCAGGAGAATGGTAAAGATGTTGGTAGCAGGAAGTTTATTTTGTAGCCTAGATTAATAAGCAGATGGATGGAGAATGGAAGCATCACCATTCTTAGTATTAAAGTAGGCGACAAAATTGAACGTAATGATGTTGAAGACAGGTTTCTTAGTCTTAGCTTGCAGTAGATAAAAAAAAATCCTGATTGTGTCAGCATTGAAATGGACAATAAAAAATTACTAACCCCTTTCACTTGTTCACATCAAATTGAAGGGAAAGATGGTAGGATTGTTTGCTCTTAGTATTTTGTCAAAACCTTTTTAAGGGGACCGTCCCTGAAGAACAAAATATCAGATTTACTATTTTTGCTTTGAAATAGAAAACGGTCTTACAGATTTTCATGAAATTTAAGTAGACGGAAGAATACCAATATTTTTTACTTTGACCATAGGGAATTTCTGATGTGACATCCTGAGTTGTGGGGTACCAAATGTAAAGAAAAATAAATATATAAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其中加粗、加下划线的碱基为候选C239T_SNP位点；（3）设计特异性引物采用PAMSA方法设计特异性引物，其正链引物一：5’‑ TAAAAGGTCACCAGACTTCATCC ‑3’；正链引物二：5’‑ TTTTCCCCTAAAAGGTCACCAGACTTCCGCT ‑3’，负链引物：5’‑ GGCAAACATACGACCACC ‑3’。