[发明专利]一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法

摘要

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的T细胞的培养方法。该方法通过HMGB1的应用，降低CD8+T细胞表面的PD‑1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果。本申请通过优化T细胞的培养体系，结合采用肿瘤微环境中应激性细胞释放的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的处理，有效降低了CD8+T细胞表面PD‑1的表达，进而使得T细胞的杀伤能力有了明显的改善，同时有效降低了细胞凋亡水平，最终使得生物免疫治疗技术能够更好的用于肿瘤治疗，对于延长病人生存质量和生存期具有较为重要的应用价值，同时由于相关处理方式较为成熟，因而具有较好的推广应用意义。

主权项

1.一种减少CD8+T细胞凋亡并增强其功能的培养方法，其特征在于，该方法通过HMGB1的应用，降低CD8+T细胞表面的PD‑1的表达，同时降低T细胞的凋亡，进而增强T细胞杀伤肿瘤的功能效果；所述HMGB1，为一种应激细胞分泌到细胞外的分泌蛋白；所述CD8+T细胞，其初始来源为外周血来源的CD8+T细胞，或者为肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞；（一）针对外周血来源的CD8+T细胞，该培养方法具体包括如下步骤：（1）采集外周血后，分离提取获得单个核细胞和自体血清，（2）磁珠分选CD8+ T细胞，具体利用CD8磁珠分选获得CD8+T 细胞；（3）体外细胞培养，具体为：第0天：将步骤（二）所获CD8+ T细胞平铺于孔板中，加入淋巴细胞培养基；然后加入A试剂，加入量为10μL/mL，再按淋巴细胞培养基体积比10%比例加入自体血清进行培养；所述A试剂为溶解有IL‑2和CD3/CD28 Dynabeads的GT‑T551无血清培养基，IL‑2的浓度为10U/μL，CD3/CD28 Dynabeads的浓度为2×105 beads/μL；第3天：加入B试剂，加入量为10μL/mL，按体积比半量方式换液加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清；所述B试剂为溶解有IL‑2的GT‑T551无血清培养基，IL‑2的浓度为10U/μL；保持B试剂终浓度为10μL/mL进行扩增培养；扩增后，加入C试剂，加入量为10μL/mL，并加入淋巴细胞培养基及其初体积10%比例自体血清，继续培养；所述C试剂为溶解有IL‑2和重组蛋白HMGB1的GT‑T551无血清培养基，其中IL‑2的浓度为10U/μL，重组蛋白HMGB1的浓度为5～20 ng/μL；培养结束后，收集细胞，检测细胞免疫表型、杀伤功能及细胞凋亡，从而对培养结果做出准确评价；（二）针对肺癌患者的肺癌组织来源的T细胞进行培养时，直接参考前述“体外细胞培养”相关操作，对T细胞进行适当扩增培养后，直接采用含HMGB1的C试剂进行处理培养即可。