[发明专利]一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法

摘要

本发明属于转录组分析领域，涉及到一种快速进行单细胞RNA逆转录与文库构建的方法。本发明能在5‑6小时内,由1‑2000个细胞或10pg‑20ng经提取的真核生物总RNA为起始，扩增出20‑500ng高质量全长双链cDNA，并获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。此发明有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和基因组DNA的污染，表达定量分子标签可辅助基因表达量计算，同时在完整扩增RNA序列信息的同时该表达定量分子标签还可保留链来源信息。本发明可获得95％以上的逆转录与扩增建库成功率，cDNA文库可无缝衔接Illumina主流测序平台，下机数据(5M Reads)可检测到90％以上的基因表达，基因表达一致性超过90％，扩增无明显偏倚，且需要的样本投入量更少。

主权项

1.一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA2)使用逆转录接头或MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；其中所述逆转录接头为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以Spacer C18修饰，其中V＝A或C或G；N＝A或C或G或T；所述MM_6N引物为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+NNNNNN，其中NNNNNN为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合(SEQ ID No.1)。3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2-5个C核苷酸；4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA模板转换；所述模板转换寡核苷酸为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTKK+1-4个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA,其中所述通用引物为：5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQID No.2)所述Index引物为：5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK，其中NNNNNN为Index，N为任意碱基(SEQ ID No.3)。