[发明专利]基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法

摘要

本发明涉及一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock‑in细胞系的方法，采用CRISPR/Cas9技术在基因组上SREBP1基因的3’端原位整合入T2A‑Luciferase报告基因，建立了SREBP1‑T2A‑Luciferase的knock‑in细胞系，并验证了此细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用已报道的对SREBP1有激活作用的转录因子LXRα对SREBP1‑T2A‑Luciferase细胞系进行转录激活，结果表明SREBP1‑T2A‑Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内SREBP1分子表达水平。该细胞系的建立将有助于SREBP1基因功能研究及筛选影响SREBP1表达的小分子化学药物，为脂代谢及其相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

主权项

1.一种基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock‑in细胞系的方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)在目的基因SREBP1的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6‑sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过的打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNAs‑SV40pA；3)构建靶向SREBP1基因的打靶载体pUC19/SREBP1‑donor，该打靶载体pUC19/SREBP1‑donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A‑Luciferase‑CMV‑eGFP‑T2A‑Neomycin‑SV40pA DNA片段；4)将pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNAs‑SV40pA与pUC19/SREBP1‑donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系；5)克隆并构建SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV‑LXRα，该表达载体pUC19/CMV‑LXRα被用于SREBP1基因的转录激活实验研究；6)验证HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映内源性SREBP1基因的相对表达量及表达变化；使用所构建的SREBP1基因的转录激活因子LXRα表达载体pUC19/CMV‑LXRα分别转染HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系和野生型HEK293细胞系，并对HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中SREBP1分子的mRNA表达水平分别进行检测；通过对knock‑in细胞系中Luciferase表达活性与HEK293细胞中的SREBP1 mRNA表达水平及变化的比较，进一步验证HEK293‑SREBP1‑T2A‑luciferase‑KI细胞系中的Luciferase活性是否可以准确反映SREBP1分子的相对表达变化。