[发明专利]一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法

摘要

本发明公开了一种早期胚胎组织的免疫组化中保持胚胎完整性的方法，属于动物生物技术领域。该方法采用聚乙烯吡咯烷酮溶液添加于早期胚胎免疫组化所用磷酸盐缓冲液、多聚甲醛、Triton X‑100、双氧水中，防止胚胎贴壁，在整个免疫组化过程中可保持胚胎完整性，提高免疫组化效果。本发明所采用的技术方案主要针对体外胚胎，在常规免疫组化步骤基础上进行了调整，调整了组织处理部分试剂成分，有效提高了免疫组化效果。本发明针对免疫组化技术存在的不足，扩大了应用范围，具有操作简便，生产成本低等优点。

主权项

1.一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法，包括以下步骤：1)溶液配制：4％多聚甲醛，0.5％Triton X‑100，双氧水20％聚乙烯吡咯烷酮储存溶液和0.1μg/mL 4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚均用PH范围为7.2‑7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，并且免疫组化用4％多聚甲醛，0.5％Triton X‑100、双氧水和磷酸盐缓冲液中均加入聚乙烯吡咯烷酮储存液，添加浓度分别为2％、4％、6％、8％、10％；2)胚胎清洗：在显微镜下，将体外培育的2细胞期、4细胞期、8细胞期和16细胞期的孤雌胚胎、孤雄胚胎或体外受精胚胎从培养液中捡出，用38.5℃下预热的加入聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；3)胚胎固定：用加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的4％的多聚甲醛在室温下固定胚胎1h，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；4)通透：用加入聚乙烯吡咯烷酮的0.5％Triton X‑100室温透化30min，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；5)去除内源性过氧化物酶：用加入聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液配置新鲜的3％H2O2，室温封闭5‑10min，用预热的含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；6)封闭：滴血清(与二抗同一来源)孵育，37℃封闭30min；7)一抗孵育：轻轻吸除封闭液，加按抗体说明用磷酸缓冲液稀释的一抗覆盖于胚胎中，将其放在湿盒中，4℃过夜；8)二抗孵育：用预热的含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，加按抗体说明用磷酸缓冲液稀释的荧光标记二抗，37℃中避光孵育30min；9)4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚染核：二抗孵育后的胚胎用含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，取10μL 0.1μg/mL 4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚溶液于胚胎上，室温5min；10)封片：用含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，95％甘油封片，盖上盖玻片；11)荧光观察：在共聚焦显微镜下观察荧光分布。