[发明专利]基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器制备方法及其应用，特点是包括以下步骤（1）将氨基化Fe3O4纳米颗粒溶液中加入到戊二醛溶液中反应后，经磁分离清洗后加入食源性致病菌捕获抗体反应后，经磁分离清洗后获得捕获单元溶液；（2）将复合纳米材料AgNPs@g‑C3N4与食源性致病菌抗体结合后获得信号单元；（3）向磁性玻碳电极表面依次滴加捕获单元、食源性致病菌样品溶液、信号单元后得到电化学免疫传感器，其应用为根据阳极溶出峰电流ip与食源性致病菌浓度之间的定量关系，测定未知样品中食源性致病菌浓度，优点高灵敏度、高特异性、检测结果可靠、步骤简单以及检测速度快。

主权项

1.一种基于快速扫描阳极溶出伏安技术检测食源性致病菌的电化学免疫传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）捕获单元的制备a. 将0.1～0.3 g FeCl2•4H2O和0.6～0.9 g FeCl3•6H2O溶于40～50 mL除氧的二次水中，氮气保护下搅拌使其混合均匀，逐滴加入28wt%氨水溶液直至反应液的pH=10，升温到80 ℃并维持此温度反应2 h，反应结束后，氮气保护下冷却至室温，水清洗至中性，定容至50 mL，即得Fe3O4纳米颗粒溶液；b. 将40～50 mL Fe3O4纳米颗粒溶液与0.4～0.6 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷混合，超声0.5 h后，室温下搅拌5～8 h，经磁分离、清洗、重新分散在50 mL水中，即得氨基化Fe3O4纳米颗粒溶液；c. 在1～3 mL 氨基化Fe3O4纳米颗粒溶液中加入0.1～0.3 mL 2.5wt%的戊二醛溶液，室温下反应1～3 h，经磁分离、清洗后加入1～3 mL 10～50 μg/mL的食源性致病菌捕获抗体，室温下反应1～3 h后，经磁分离、清洗后，分散在10～20 mL pH=7.5～8.2的磷酸盐缓冲溶液中，即得捕获单元溶液；（2）信号单元的制备a. 称取5～10 g三聚氰胺粉末，马弗炉中500～600 ℃下煅烧3～5 h，真空干燥过夜后，即可得到氮化碳粉末，取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 M HNO3溶液中，120～150 ℃下回流16～20 h，冷却到室温后，12000 rpm离心，水洗至溶液pH=7，将所得沉淀物连续超声16 h，真空干燥后即得石墨相氮化碳；b. 在30～60 mL水中加入1～3 mL 10 mM AgNO3溶液，加热至沸腾，再加入1～3 mL 1wt%柠檬酸三钠溶液和300～500 μL 3 mM NaBH4溶液，沸腾状态下剧烈搅拌1 h，冷却到室温后，离心，清洗，分散到40～60 mL水中，即得纳米银粒子溶液；c. 在10～70 mL 纳米银粒子溶液中加入30～70 mg 石墨相氮化碳，室温下搅拌16～24 h，水洗离心，弃上清液，分散到40～60 mL水中，即得复合纳米材料AgNPs@g‑C3N4溶液；d. 取200 μL复合纳米材料AgNPs@g‑C3N4溶液，加入120～150 μL含10～100 mmol/L 1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和1～10 mmol/L N‑羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，0.8～1.2 M盐酸调pH为4.0～6.0，35 ℃下孵育1～2 h，离心，洗涤，水定容至200～300 μL，用0.1～0.2 M NaOH溶液调pH为7.0～9.0，加入80～120 μL 0.01～1 μg/mL 食源性致病菌抗体后孵育3～5 h，再加入80～100 μL 2wt%牛血清白蛋白溶液孵育1～2 h以封闭活性位点，清洗，离心，分散到5～10 mL水中，即得信号单元sAb‑AgNPs@g‑C3N4；（3）电化学免疫传感器的组装a. 将磁性玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm Al2O3抛光至镜面，再依次用50vt%的乙醇溶液、50 vt %的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗；b. 向磁性玻碳电极表面滴加5～10 μL捕获单元，然后滴加5～10 μL食源性致病菌样品溶液，室温孵育30～50 min后，水清洗，再加入5～10 μL信号单元，室温孵育30～50 min后，水清洗，即得电化学免疫传感器。