[发明专利]一种慢病毒制备方法

摘要

本申请涉及病毒生物技术领域，具体公开了用于真核细胞转染的慢病毒载体的制备和储存技术，其包括步骤293T细胞的培养、病毒包装质粒的转染步骤真核细胞的培养、病毒包装质粒的转染、转染后培养、收集细胞培养的上清液、上清液的预处理、浓缩纯化慢病毒、重悬于病毒缓冲液制剂中冷冻储存，其转染采用阳离子聚合物法。本发明的慢病毒载体的制备和储存技术从病毒制备质粒转染、病毒纯化方法以及病毒存储几个方面着手，致力于病毒稳定性和活性的保持以及提高。本发明对病毒制剂优化后的制剂其病毒稳定性明显优于传统的制剂，所保存的慢病毒载体在对制剂不同时间不同温度反复冻融的稳定性较为理想，可考虑推广应用。

主权项

一种慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：(1)真核细胞的培养，(2)慢病毒载体包装生产；(3)病毒包装质粒的转染，(4)转染后培养，(5)收集细胞培养物，固液分离取液体部分，(6)液体部分的预处理，(7)浓缩纯化慢病毒；(8)在病毒缓冲液制剂中冷冻储存；所述步骤(1)293T细胞的培养，包括细胞复苏，扩大培养和接种到工厂化培养装置大规模培养；所述步骤(2)慢病毒载体包装生产是采用第三代病毒包装质粒系统进行CAR慢病毒载体包装生产，将获得的慢病毒转染真核细胞；所述步骤(3)转染的方法优选阳离子聚合物基因转染法；所述步骤(4)转染后培养是将转染的真核细胞接种到工厂化大规模培养装置；所述步骤(5)收集细胞培养的液体部分包括不同培养时间的上清液；在一具体实施例中包括慢病毒转染真核细胞24～72小时内不同培养时间的细胞培养物的上清液；所述步骤(6)液体部分的预处理的方式包括滤膜过滤；所述步骤(7)浓缩纯化病毒包括超速离心。其中所述步骤(8)中的病毒缓冲液制剂Buffer组成包含选自PBS磷酸盐缓冲液、0.5M蔗糖、人血清白蛋白(HAS)、N‑(2‑羟乙基)哌嗪‑N'‑2‑乙烷磺酸(HEPES)Buffer、Hank Buffer、三羟甲基氨基甲烷(Tris)Buffer、氯化钠、勃脉力A(Plasmalyte A)、葡萄糖、葡聚糖中的一到多种；所述包装质粒为第三代质粒包装系统，所述第三代质粒包装系统包括CAR转移质粒、包装质粒、VSV‑G包膜质粒，所述CAR转移质粒、包装质粒、VSV‑G包膜质粒的比例为10:3:1～1:3:2。