[发明专利]一种脂氧酶以及7S球蛋白双缺失的大豆新种质的建立方法

摘要

本发明公开了一种脂氧酶以及7S球蛋白双缺失的大豆新种质的建立方法。该方法利用本发明改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法从大豆种质中筛选获得7S球蛋白的α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆品种，然后以脂氧酶三个同工酶同时缺失的东富豆3为母本，以7S球蛋白三个亚基同时缺失的大豆品种为父本配置杂交组合，利用本发明改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，进行7S球蛋白与脂氧酶缺失检测，获得脂氧酶以及7S球蛋白同时缺失的大豆新种质。该方法不但可以降低检测成本、节约检测时间2倍以上，还可以降低检测废弃物的排放2倍以上，减低环境污染，更重要的是它解决了基因聚合育种过程中低世代分析检测的瓶颈，为大豆品质改良育种提供了最佳的检测方法。

主权项

1.一种脂氧酶以及7S球蛋白双缺失的大豆新种质的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法从大豆种质中筛选获得7S球蛋白的α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆品种；所述的改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，按照以下步骤进行：(1)痕量取样：采用半粒切取法或者垂直钻取法进行取样；1)半粒切取法：用裁纸刀片在大豆种脐相反侧，用刀片逐粒纵向切取5‑8mg子叶粉末，并按顺序逐粒放入96孔板，加盖，5℃低温保存待分析，保存时间若超过2周，放入‑20℃冷冻保存；2)垂直钻取法：以钻头的牙科用打磨钻，替代裁纸刀片，垂直于子叶正面，钻取子叶粉末5‑8mg，按顺序逐粒放入96孔板，加盖，5℃低温保存待分析，保存时间若超过2周，放入‑20℃冷冻保存；(2)种子摆放方法：为了确保取样后的种子与其取样样品检测结果的准确对应，取样后的待确认种子摆放顺序，须与样品放入96孔板顺序及用12道微量移液器上样电泳的顺序完全保持一致，待检测结束后，根据检测结果，可以直接找到目标种子；(3)试剂配制A液：Tris：363g；SDS：4g，用HCl调pH至8.8，定容至1000ml；B液：Tris：30g；SDS：4g，用HCl调pH至6.8，定容至1000ml；C液：Acrylamide：300g；Bisacrylamide：8g，定容至1000ml；E液：核黄素：8mg，定容至1000ml；P液：过硫酸铵：7.5g，定容至500ml；染色液：冰乙酸：200ml；甲醇：900ml；G250：5g，定容至3000ml；脱色液：冰乙酸：150ml；甲醇：600ml，定容至3000ml；蛋白质提取液：Tris：6.057g；溴酚蓝：20g；甘油：30g；β‑巯基乙醇20g，用HCl调pH至8.0，定容至1000ml；10×电泳缓冲液：Tris：30g；SDS：10g；Glycine：144g，定容至1000ml；(4)样品前处理方法将步骤(1)得到的子叶粉末放入规格为8×12方格的样品盒中，用排枪在每个方格中加入500μl的蛋白提取液，振荡1min，随后超声萃取8min，室温下静置30min，再次振荡混匀后，5000rmp离心5min，最后取10μl上清液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)电泳胶板的制备1)分离胶的制备：以制作4枚规格为14cm×13cm×1mm厚、浓度为6.75％的聚丙烯酰胺凝胶为例：按先后顺序依次将A液18.0ml，C液15.6ml，P液3.6ml，蒸馏水34.8ml加入200ml的锥形瓶中，一边加一边摇晃，最后加入48μl的TEMED；2)浓缩胶的制备按先后顺序依次将B液6.4ml，C液4.0ml，P液0.8ml，E液5.2ml，蒸馏水7.6ml加入100ml的三角瓶中，边加边摇晃，最后加入24μl的TEMED；(6)ISDS‑PAGE凝胶电泳接通电泳仪的电源，打开连接电泳槽的冷凝水，以120V电压电泳1h，之后换180V电压电泳3.5‑4h，电泳结束后，将做好标记的分离胶放入染色液中，轻摇染色1.5‑2h，之后取出放入脱色液中，轻摇脱色4h以上，之后将胶板取出放入装有蒸馏水的塑料盒中，放置在荧光灯箱上面观察7S球蛋白亚基的缺失状况，并用凝胶成像仪扫描分析；(二)以脂氧酶三个同工酶同时缺失的东富豆3为母本，以7S球蛋白的α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆品种为父本配置杂交组合；利用经改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，按照步骤(1)‑(6)在F1代进行杂合体检测，确认所获得的F1种子，均表现为7S球蛋白α、α'与β三个亚基缺失，但脂氧酶均不缺失性状，F1种子经海南南繁加代，收获F2种子，再利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，按照步骤(1)‑(6)对F2分离世代种子通过痕量取样检测法，进行7S球蛋白α、α'与β三个亚基与脂氧酶缺失检测，获得脂氧酶三个同工酶以及7S球蛋白α、α'与β三个亚基同时缺失的大豆新种质。