[发明专利]一种牙髓间充质干细胞的培养方法

摘要

一种牙髓间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：准备牙髓样本，分离培养牙髓间充质干细胞，克隆化培养分离牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞检测，牙髓间充质干细胞检测染色。本发明的有益效果在于：1、利用克隆分离培养的细胞之间排列紧密，中心部细胞界限不清。呈圆形或不规则状及形成细胞结节样，周边部细胞呈多角形或短梭形，胞浆较少，核浆比例大，核仁明显，部分细胞呈成纤维状；2、不会产生严重的免疫排斥问题；3、取材方便安全和交叉感染风险小，可以用于修复缺损牙齿及牙齿再生；4、可促进皮肤伤口愈合及再生，延缓衰老或治愈失明，此外，牙髓干细胞还可治疗心脏病、类风湿性关节炎、烧伤、中风或软骨受损等，用途广泛。

主权项

1.一种牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、准备牙髓样本：将牙齿样本浸泡在缓冲溶液或将牙齿样本冷藏保存，其保存时间在40h~47h，其后劈开牙冠，取出牙髓;S2、分离培养牙髓间充质干细胞:用0.01M冻存液PBS冲洗后，将取出的牙髓剪成约1mm3×1mm3×1mm3小块，再用0.3%的I型胶原酶和0.4%的分解酶在37℃中消化1h，轻轻吹打离散单细胞团块，将形成的单细胞悬液通过孔径为70μm的细胞筛网后800r/min离心5min；再用0.01M冻存液PBS冲洗一次，将细胞沉淀，同时将密度5000/cm2的干细胞培养基接种于培养瓶中培养，每3d换液1次；S3、克隆化培养分离牙髓间充质干细胞：待细胞生长达80％~85%汇合度时，用0.25%的胰酶消化传代，再用0.01M冻存液PBS冲洗一次，将细胞沉淀，同时将密度5000/cm2的干细胞培养基接种于培养瓶中培养，每3d换液1次，其中等细胞生长达80％汇合度时，用0.25%的胰酶消化收获；S4、牙髓间充质干细胞检测：将收获的子代牙髓间充质干细胞，利用PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106/ml，取出1ml，加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀，在4℃下过夜并离心弃乙醇后再流式细胞仪上进行细胞周期检测；S5、牙髓间充质干细胞检测染色。