[发明专利]一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法及试剂

摘要

本发明公开了一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR‑SSP的方法及试剂，首先针对Vel血型基因SMIM1野生型序列和SMIM1 c.64_80缺失突变序列分别设计特异性扩增引物（文中分别用+p和‑p表示）；确定最适汇集标本数，将标本按一定数量（n）进行汇集；使用缺失突变序列特异的引物‑p扩增汇集标本。由于缺失突变序列为稀有序列，那么出现特异性目的条带的有反应性汇集是少数，此过程即可将筛查工作的时间和经济成本降低n倍。针对出现的有反应性汇集，则同时用+p和p两种引物分别扩增汇集中的单个标本，可初步判断参与汇集的单个标本的基因型，通过基因测序验证标本基因型。本发明可特异准确地鉴定Vel血型基因，并可大大降低筛查工作的时间及经济成本，提高筛查效率。

主权项

1.一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备基因组DNA作为随机待检标本；2)合成Vel-对照品质粒pVel-：选取SMIM1c.64_80纯合缺失突变序列插入载体质粒pUC57-Simple进行合成制得；3)调节对照品质粒pVel-的使用浓度，使对照品质粒pVel-与随机待检标本所含模板的摩尔数在同一数量级；4)针对SMIM1野生型和SMIM1c.64_80缺失突变序列分别设计并合成特异性扩增引物，分别命名为+p和-p；5)确定最适样本汇集数(n)：将不同数量(1，3，5，......n-1)的随机待检标本与对照品质粒pVel-汇集，分别模拟2样、4样、6样......n样汇集，使用-p进行PCR-SSP，采用琼脂糖凝胶检测扩增结果；根据扩增效果，并结合参与汇集的单个随机标本的DNA浓度，选定最适的汇集标本数；6)将基因组DNA标本每n样进行汇集，使用-p进行PCR-SSP；对照品质粒pVel-作为实验体系的质控品以及Vel-个体的阳性对照同时被扩增；7)对步骤6)中扩增出现特异性目的条带的汇集，即有反应性汇集，进行拆分检测；使用+p和-p两种引物分别扩增有反应性汇集中的单个标本，根据反应格局判断汇集中每个标本的基因型为野生型、杂合缺失突变序列或纯合缺失突变序列；8)对杂合缺失突变序列或纯合缺失突变序列进行基因测序分析鉴定基因型。