[发明专利]一种定量检测芒果炭疽菌的方法

摘要

本发明公开了一种定量检测芒果炭疽菌的方法，该方法步骤为：对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；特异性引物的制备；RealAmp反应；RealAmp标准曲线的构建；结果判断。本发明方法是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定的优点；本发明可以定量检测芒果炭疽病，并可以区分两种主要病原菌芒果胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌；分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。

主权项

1.一种定量检测芒果炭疽菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；步骤二、特异性引物的制备；步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；步骤四、采用RealAmp的外侧引物对F3/B3扩增芒果炭疽菌基因组DNA,克隆扩增产物到pMD18‑T载体，用于构建RealAmp标准曲线；步骤五、结果判断；所述步骤二为：在炭疽菌的ITS1‑5.8S‑ITS4的保守区间内，利用CgInt/ITS、CaInt2/ITS4引物对扩增序列的重叠区域作为靶标设计出两对特异性引物；所述两对特异性引物包含内侧引物与外侧引物各一对，其中F3和B3为外侧引物，FIP和BIP为内侧引物，所述外侧引物F3为5′‑AAGTCGTAACAAGGTCTCC‑3′，所述外侧引物B3为5′‑CGTTCTTCATCGATGCCAG‑3′，所述内侧引物FIP为5′‑CCGAAGCAACGGTTAGGTATGTGTAGGTGAACCTGCGGAG‑3′，所述内侧引物BIP为5′‑CCGCCGGAGGAAACCAAAAACCAAGAGATCCGTTGTT‑3′；所述步骤五为：定量检测结果的判断：在ESE‑Quant Tube Scanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果；定性检测结果的判断：反应结束后用手甩或者离心将反应管内盖上的SYBR Green I混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性；定性和定量分析结束后，在RealAmp的反应液中加入Nae I内切酶，37℃酶切3hr后，2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析：可以酶解开的是尖孢炭疽菌，酶解不开的是胶孢炭疽菌，部分酶切产物的则是两个病原菌的混合侵染。