[发明专利]一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法

摘要

本发明利用组织快法制备了胎盘干细胞，并采用超声波破碎法收集细胞内的细胞因子与上清中的细胞因子混合，在低温环境下冻干，充分保证了胎盘干细胞因子的浓度及活性。本发明的制备方法所制备的冻干粉有效地保存了人胎盘间充质干细胞中的各种具有生物活性的细胞因子混合物，保存期可延长到2年，有效地解决细胞因子溶液保存期有限这一瓶颈，为人胎盘间充质干细胞细胞因子的产业化应用奠定了基础。

主权项

1.一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：⑴、胎盘干细胞的分离和培养：在无菌条件下，收取健康的胎盘，在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5‑2.5mm3大小的组织块，将其置于T175培养瓶所盛的DMEM‑LG细胞培养液中，置37℃，5％CO2培养箱中培养；每隔2‑3天换液，直至胎盘干细胞析出，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素DMEM‑LG培养基，并进行传代培养；⑵、细胞因子的收集：第三代后，细胞长至90％左右可开始收集细胞因子；将细胞状态良好的细胞收集起来，进行超声破碎，使其将细胞内未完全释放的细胞因子释放出来；并1500rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀；⑶、干细胞提取物的超低温冻干：将去除细胞碎片沉淀的胎盘干细胞培养原液加入10％BSA作为赋形剂，充分溶解后，用0.45um的无菌过滤器过滤除菌，并分装至2ml西林瓶中，每瓶1ml；分装后将西林瓶置于‑80℃超低温冰箱中进行预冻干，预冻12h后取出，再置于冻干机内冷冻干燥；即得到胎盘间充质干细胞冻干粉。⑷、冻干前后干细胞因子的活性检测：配制冻干粉溶媒；利用3T3细胞的增殖曲线，模拟成纤维细胞在细胞因子促进下的生长情况；将3T3培养后，采用胰酶消化，计数后，将细胞铺至四块六孔板，每两块一组，且每块四孔，其中每孔1*103个细胞；设定第一组为对照组，在所述对照组中添加步骤⑵中收集的细胞；设定第二组为实验组，在所述实验组中添加冻干后用溶媒溶解的细胞因子；分别培养24h、48h、72h、96h后，每板取1孔计数，绘制生长曲线。