[发明专利]用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备和使用方法

摘要

一种用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备和注射方法，包括以下步骤：血管内皮干细胞的培养、血管内皮干细胞的鉴定及检测、血管内皮干细胞的冻存、及血管内皮干细胞制剂的制备与激活。本发明利用一种体外激活剂将复苏后的血管内皮干细胞激活后直接使用，一方面避免了复苏后需经培养激活才能保持最佳活力的过程，另一方面增加了血管内皮干细胞刺激生成海绵体血管的能力，更利于未来临床的开展。作为治疗男性勃起障碍的药物，其单独使用，治疗男性勃起障碍效果较好。

主权项

1.一种用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：血管内皮干细胞的培养、血管内皮干细胞的鉴定及检测、血管内皮干细胞的冻存、及血管内皮干细胞制剂的制备与激活；其中，所述血管内皮干细胞的培养，包括以下步骤：①带无菌手套，取出选好的健康脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；②在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2根粗丝线扎牢，用30ml注射器抽吸Cord Buffer冲洗静脉腔，至将脐血洗净；③赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6‑8ml，放入37℃Cord Buffer中保温6‑10min；④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；⑤离心，1500rpm，10min，弃上清，收集细胞；⑥配制培养液：⑦用新鲜配制的培养液重悬步骤⑤所收集的细胞，吸入T75培养瓶；⑧置于37℃、5％CO2培养；⑨细胞长至80‑90％左右，开始消化、传代；所述血管内皮干细胞的鉴定及检测，包括流式鉴定、内毒素检测、真菌细菌检测和支原体检测；所述血管内皮干细胞的冻存，包括：将经流式、内毒素、真菌、细菌及支原体检测合格的细胞进行冻存；去除培液，用PBS清洗细胞两次；加入3mL胰酶消化细胞；摇晃培养瓶使胰酶覆盖细胞单层；倒出多余的胰酶，将培养瓶放回培养箱，放置1min，用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞；加入10mL含血清的培液终止消化；取出100‑200μL用于计数；将剩余的细胞1000rpm离心5min，在冻存液中，以2×106个细胞/mL的密度重悬细胞，吸取5mL细胞悬液转移至标有细胞系名称、传代次数、冻存日期的冻存管中，将冻存管放置在4℃冰箱30min，之后放入‑20℃冰箱中2小时左右，再放入‑80℃冰箱过夜，最后将冷冻的冻存管转移到液氮罐中保存；所述血管内皮干细胞制剂的制备与激活，包括以下步骤：先从液氮罐中取出冻存的血管内皮干细胞，立即置于37℃水浴锅中水浴；在1000rpm离心5min，则将血管内皮干细胞复苏；将复苏后的细胞用生理盐水重悬、洗涤，1000rpm，离心5min，去上清，再重复洗涤一次；然后，加入2ml激活剂重悬细胞，细胞重悬后，室温静置孵育15min激活后，吸入两支1ml胰岛注射器内。