[发明专利]检测SA肠毒素SEI的试剂及制备方法和试剂盒

摘要

本发明公开了快速检测SA(金黄色葡萄球菌)肠毒素SEI的试剂及制备方法和所构成的试剂盒，通过基因工程技术制备了SA重组肠毒素SEI，并与抗SA肠毒素SEI单克隆抗体和羊抗鼠IgG配合组装成ICCGIC试纸条，实现针对液体奶中SA肠毒素SEI的快速、简便、准确的检测。

主权项

1.一种检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于主要包含以下过程：SA的培养及其基因组DNA的提取：将SA接种在LB液体培养基中培养，取对数生长期的SA培养液离心处理，收集菌体，弃上清，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取SA基因组DNA，待用；SA肠毒素SEI基因扩增引物的设计：根据已有SA肠毒素SEI基因序列设计扩增SEI基因序列的特异性引物，在上游引物和下游引物5'端分别引入BamHI和HindIII限制性酶切位点，同时，设计扩增该基因的荧光定量RT‑PCR引物，SA肠毒素SEI基因的扩增与克隆：配制PCR反应体系，该反应体系包括：SA基因组DNA模板，10×PCR buffer，dNTPs，上游引物SEI FP1、下游引物SEI RP1，ddH2O，Taq DNA聚合酶，将所有试剂加入PCR反应管中并充分混匀，在不同温度段下进行PCR反应，用1‑2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将扩增产物电泳后进行回收，与pMD19‑T载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，经氨苄青霉素抗性平板筛选及菌液PCR验证后，获得重组质粒pT‑SEI，SA肠毒素SEI基因的表达：按照分子克隆的方法，将含有SEI基因片段的重组质粒重组质粒pT‑SEI与原核表达pET‑28a(+)质粒分别用BamHI和HindIII限制性内切酶进行双酶切，然后分别回收目的片段和载体片段，用T4DNA连接酶进行过夜连接，并将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中36‑38℃振荡培养12‑24小时，构建pET‑SEI重组表达质粒，按照分子克隆常规方法，将鉴定正确的pET‑SEI重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，用IPTG诱导培养6‑8h，离心收集菌液并加入Lysis Buffer裂解菌体，液氮和40‑45℃水浴反复冻融2‑5次后进行超声破碎，每次8‑12s，间歇8‑12s，80‑100次/周期，直至菌液清亮为止，得到SA重组肠毒素SEI，冷冻保存。