[发明专利]草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定

摘要

本发明涉及草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定，包括以下步骤：克隆得到草鱼ICAM‑1编码序列；提取草鱼ICAM‑1活性蛋白的重组表达质粒；ICAM‑1蛋白在COS‑7细胞中的表达；草鱼血淋巴细胞的分离及染色；草鱼血淋巴细胞的粘附实验。本发明的技术特点是：ICAM‑1对淋巴细胞跨内皮细胞作用是必需的，该基因分离鉴定可用于鱼类免疫学机制研究；血清中存在着可溶性的ICAM‑1（sICAM‑1），它来自于蛋白酶切割膜形式的ICAM‑1；在临床上，检测血清中的sICAM‑1水平可用于辅助诊断鱼病。

主权项

1.草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定，其特征在于，包括以下步骤：S1、克隆得到草鱼ICAM‑1编码序列：从草鱼基因组中找到ICAM‑1的序列，设计引物，从草鱼头肾组织中克隆得到草鱼ICAM‑1的编码序列和氨基酸序列；S2、提取草鱼ICAM‑1活性蛋白的重组表达质粒：对草鱼ICAM‑1的编码序列进行酶切位点扫描分析，对照载体pcDNA3.1/myc‑His(‑)的多克隆位点上的酶切位点，选择目的基因编码序列所不含的酶切位点作为构建质粒的酶切位点，设计含有酶切位点的引物，PCR扩增，进行胶回收产物，然后进行双切酶消化反应，用连接酶将其连接到所需载体，在42℃热激转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并培养，提取草鱼ICAM‑1活性蛋白的重组表达质粒；S3、ICAM‑1蛋白在COS‑7细胞中的表达：设定温度下，将草鱼ICAM‑1活性蛋白的重组表达质粒转染到含COS‑7细胞的培养基中，转染表达；S4、草鱼血淋巴细胞的分离及染色：用断颈法收集草鱼血液按1:1加入培养基并混匀，通过密度梯度离心处理得到草鱼血淋巴细胞，将得到的草鱼血淋巴细胞分为两份，其中一份加入细菌脂多糖进行处理后，向两份草鱼血淋巴细胞加入荧光染料进行孵育染色处理；S5、草鱼血淋巴细胞的粘附实验：将荧光染料标记的草鱼血淋巴细胞加入转染有ICAM‑1表达质粒或空载的COS‑7细胞中孵育；将同样数目未经荧光染料染色的细胞加入到转染有ICAM‑1表达质粒或空载的COS‑7细胞中孵育作为负对照，孵育结束后，用预热的缓冲液洗除去未粘附的细胞，对粘附的细胞分别进行荧光测试。