[发明专利]一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法

摘要

本发明公开了一种mPEG‑Mal5000修饰β‑淀粉酶的方法，mPEG‑Mal5000作为修饰剂，最佳修饰工艺参数为mPEG‑Mal5000添加比例为1:4、修饰反应温度为58℃、修饰反应pH为6.0，反应时间为10min。mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶的比酶活力为（2.08±0.055）万U/mg，酶活比未修饰β‑淀粉酶提高了20.10%；修饰后酶动力学参数Km降低了12.95%，Vmax提升了26.87%，在温度为30℃‑70℃时，mPEG‑β‑淀粉酶耐热性明显高于β‑淀粉酶耐热性。在pH6.5‑7.5时，mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶pH稳定性明显高于β‑淀粉酶pH稳定性。

主权项

1.响应面法优化mPEG‑Mal5000修饰β‑淀粉酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）mPEG‑Mal5000修饰β‑淀粉酶向试管中加入8.0 mL磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/L β‑淀粉酶酶液1.0 mL和1.0 mL mPEG‑Mal5000溶液，置于恒温金属浴中震荡10min~30min，取反应液进行透析24h，待透析完毕，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力；（2）实验设计与统计分析改变mPEG‑Mal5000溶液浓度使β‑淀粉酶与mPEG‑Mal5000的摩尔比为1:1~ 1:6、恒温金属浴的温度为25℃~75℃、磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液的pH为3.0~8.0，进行单因素实验，测定比酶活力；根据单因素试验结果，选取比酶活力影响较显著的β‑淀粉酶与mPEG‑Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度、磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液的pH这三个因素，并对其进行实验因素与水平的设定，然后进行实验；（3）模型的建立和统计分析根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量β‑淀粉酶与mPEG‑Mal5000的摩尔比B、恒温金属浴的温度C、磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液的pH值A与响应值比酶活力Y的二次多项回归方程：Y=2.15+0.025*A+0.00528*B+0.016*C‑0.033*A*B+0.027*A*C+0.0011*B*C‑0.17*A2‑0.13*B2‑0.13*C2；（4）试验结果分析与优化根据回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面三维图，响应值由此得到优化，根据模型分析可得到β‑淀粉酶与mPEG‑Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度和磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液的pH的最优化工艺参数。