[发明专利]一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法及其应用在审
| 申请号： | 201810160407.9 | 申请日： | 2018-02-27 |
| 公开（公告）号： | CN108486139A | 公开（公告）日： | 2018-09-04 |
| 发明（设计）人： | 谭国强;庞一林;吕建新;李江辉;杜璟;李唐 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 温州匠心专利代理事务所(特殊普通合伙) 33279 | 代理人： | 胡仁勇 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市瓯海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法、试剂盒及其应用。所述方法步骤如下：根据突变位点处的序列分别设计5′端包含互补同源臂序列的正向和反向突变引物，突变位点可位于同源臂中任一位置；在质粒的非突变位点区分别设计5′端包含另一互补同源臂的正向和反向引物，PCR扩增出的两个一端包含突变位点的片段，需存在500bp以上的大小差异；对于多位点突变，根据突变位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；采用同源重组酶将2‑5个片段一步无缝拼接，构建具有目标突变位点的环状质粒。所述方法相对经典的重叠延伸PCR法，具有快速简便，可对小于40kb质粒任意位置实现单点或多点、连续或不连续突变，突变效率达100％的特点。 | ||
| 搜索关键词： | 突变位点 突变 同源臂 基因定点 突变引物 点数 正向 质粒 克隆 重叠延伸PCR 同源重组酶 大小差异 反向引物 环状质粒 任一位置 无缝拼接 不连续 点突变 试剂盒 单点 多位 构建 应用 | ||
【主权项】：
1.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：通过设计两对引物扩增构建单位点突变质粒，其中一对引物是根据突变位点处的序列分别设计5′端包含互补同源臂序列的正向突变引物和反向突变引物，突变位点可位于同源臂中任一位置；另一对引物是在质粒的非突变位点区分别设计5′端包含另一互补同源臂的正向引物和反向引物，引物中同源臂大小为15‑20bp；然后采用无缝克隆技术，将高保真酶扩增出的两个一端包含突变位点的片段进行无缝拼接，构建具有目标突变位点的环状质粒。
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