[发明专利]一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及一种生物检测技术领域，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特点是，由根据抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列设计的特异性引物、捕获探针、检测探针，优化的NASBA扩增体系和优化的NASBA产物检测体系组成。能对玉米中抗草丁膦抗性基因成分进行简单快速的检测，具有高效的特异性和容易推广的优越性，也有助于转基因玉米中的抗草丁膦抗性基因成分bar的早期诊断；其检测方法是设计并人工合成抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列的特异性引物、捕获探针和检测探针，确定NASBA扩增反应程序和NASBA产物检测体系等步骤，检测方法避开了对特殊设备和专业人员的需求，结果灵敏度高且重复性好。

主权项

1.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，它包括如下体系：1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的一对特异性引物bar‑F：5’‑GATGCAAGGTCGCATATGAG‑GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG‑3’；bar‑R：5’‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG‑3’，下划线为T7启动子序列；(b)NASBA扩增缓冲液：Tris‑HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的探针特异性探针，即捕获探针：5’‑Biotin‑ATGCAAGGTCGCATATGAGT‑3’，检测探针：5’‑DIG‑AAGTCCAGCTGCCAGAAA‑3’；(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/LTris‑HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％Tween‑20；显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O，加入1mL二乙醇胺，‑20℃避光保存；终止液：0.5mol Na2CO3溶液。