[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法

摘要

一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR‑gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。

主权项

1.一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)针对SEQ ID NO:1所示的HMGCR基因片段设计如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的CRISPR/Cas9靶标序列，接着合成如SEQ ID NO:4、5和SEQ ID NO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒PX459‑HMGCR‑gRNA1和PX459‑HMGCR‑gRNA2；2)将上述两质粒分别转染至PK15细胞中，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；提取嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA，以该提取的DNA为模板，用如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的HMGCR基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用T7E1酶进行酶切鉴定。