[发明专利]重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201810239679.8 | 申请日： | 2018-03-22 |
| 公开（公告）号： | CN108314709A | 公开（公告）日： | 2018-07-24 |
| 发明（设计）人： | 王秀然;刘思阳;付玉芹;王岩;卢天成;李思圆;孙喆;李海燕;胡祥坤;王茗宇;郑晗旭 | 申请（专利权）人： | 吉林农业大学 |
| 主分类号： | C07K14/23 | 分类号： | C07K14/23;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/31;C12N15/81;A61K39/39;A61K39/10;A61P31/04 |
| 代理公司： | 长春众邦菁华知识产权代理有限公司 22214 | 代理人： | 于晓庆 |
| 地址： | 130118 吉林省*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | 一种重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用，涉及重组蛋白领域。本发明包括：对p39基因进行克隆，将PCR片段与克隆载体pMD‑19T(Simple)相连，经测序和酶切验证正确后将目的片段与真核表达载体pPICZαA相连构建重组表达质粒pPICZαA‑P39；电转化法将质粒pPICZαA‑P39转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，经诱导表达，亲和层析纯化，分子筛进一步分离纯化后经western blot验证即为目的蛋白，最佳发酵条件为：pH6、磷酸盐浓度0.02M、甲醇诱导浓度1％、诱导72h，纯化后的重组蛋白P39浓度为5mg/ml。本发明为布鲁氏菌流行性疾病免疫预防奠定基础。 | ||
| 搜索关键词： | 质粒pPICZ α A 制备方法和应用 重组糖基化 重组蛋白 蛋白 验证 分子筛 亲和层析纯化 真核表达载体 重组表达质粒 最佳发酵条件 流行性疾病 毕赤酵母 布鲁氏菌 电转化法 分离纯化 甲醇诱导 克隆载体 免疫预防 目的蛋白 目的片段 诱导表达 磷酸盐 测序 构建 酶切 诱导 克隆 转化 | ||
【主权项】：
1.一种重组糖基化蛋白P39的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、真核表达载体pPICZαA‑P39的构建对p39基因进行克隆，将PCR后的片段与克隆载体pMD‑19T(Simple)相连，经测序和酶切验证正确后，将双酶切后获得的目的片段与同样经双酶切的真核表达载体pPICZαA相连构建重组表达质粒pPICZαA‑P39；步骤二、P39蛋白在毕赤酵母GS115中的表达、纯化及发酵利用电转化法将构建好的真核表达载体pPICZαA‑P39转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇进行蛋白的诱导表达，应用亲和层析方法对目的蛋白进行纯化，并利用分子筛进一步分离纯化目的蛋白，并利用westernblot对纯化的蛋白进行验证，通过优化单因素实验得到最佳发酵条件为：pH值为6、磷酸盐浓度为0.02M、甲醇诱导浓度为1％、诱导72h，纯化后的重组蛋白P39浓度为5mg/ml。
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