[发明专利]一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法

摘要

本发明公开了一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，通过蛋白质组学方法，研究长期定位施用高低氮肥对夏玉米鲁玉16籽粒清蛋白的影响。结果表明，对照组的清蛋白含量高于两处理组且在定量单向SDS‑PAGE中可以看出有明显的差异条带。双向电泳结果显示，长期低氮处理与对照组相比共有7个差异蛋白点，1个上调，6个下调；长期高氮处理与对照组相比共有6个差异蛋白点，1个上调，5个下调。通过质谱鉴定并对其进行功能分类，分别为蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白、能量代谢相关蛋白、表达调控及防御抗逆相关的蛋白、细胞代谢相关的蛋白及功能未知蛋白。

主权项

1.一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、试验设计供试土壤为非石灰性潮土， 发育于冲积母质， 表土质地轻壤，有机质含量为4.10 g/kg， 全氮量为0.50 g/kg，全磷量为0.46 g/kg， 土壤有效磷为15 mg/kg，土壤速效钾为38 mg/kg， 土壤阳离子代换量为11.80 cmol/kg；试验共设3个处理：对照组、低氮、高氮，每个处理设3次重复；试验地实行冬小麦—夏玉米轮作制，每年两作，夏玉米品种为鲁玉16，高量氮肥年施用量为276 kg/hm2，低量氮肥年施用量为138 kg/hm2 ；步骤2、测定项目与方法2.1籽粒清蛋白的提取及测定取 0.5g 样品加入 2ml 水，研磨至匀浆， 再加入 3ml 水转移至离心管中，用 3ml 水冲洗研钵并振荡5min，4500r/min 离心 8min，倒出上清液，加水 8ml，搅拌，振荡 5min， 离心，合并上清液，共4次，用水定容至 50ml；分别吸取各样液 1ml，加入考马斯亮蓝 5ml， 混匀，放置2min，595nm 比色；2.2籽粒清蛋白的SDS‑ PAGE电泳装置为 DYZC‑24B 型电泳仪，板胶厚 1mm；分离胶浓度为 12%，浓缩胶浓度为 5%；将200µg 样品加入点样孔；开始时电压为 100 V，待溴酚兰完全进入浓缩胶界面后，换成120V 恒压电泳至结束；电泳后，用考马斯亮蓝染色，并脱色，扫描成像；2.3籽粒清蛋白的纯化与定量取上述清蛋白提取液用丙酮沉淀，12000 r/min离心1h，用裂解液溶解；用2‑D Clean‑Up Kit纯化蛋白试剂盒纯化蛋白后，用水化液溶解蛋白；采用 Bradford法定量，以牛血清白蛋白为标准蛋白；2.4籽粒清蛋白的 2 ‑DE取含 200 µg 蛋白质的上述蛋白质提取液，用上样水化缓冲液补充体积到 450µl后，将24 cm、pH 4~ 7的固相 pH 梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶液上方，被动水化 17 h，然后进行等电聚焦：20℃，100V，1 h；300 V，1 h；500V，1 h；1000 V，2h；8000V，3h；8000 V，10h；聚焦结束后，分别用含1% DTT 和2.5%碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液平衡胶条各15 min；平衡完毕后，将胶条紧贴在 12%的聚丙烯酰胺凝胶上方，进行第二向电泳； 电泳结束后采用改进的银染方法对凝胶进行染色，然后用UMAX Powerlook2100XL扫描仪扫描图像，所获图像用ImageMaster platinum6 分析软件进行分析，实验重复 3 次；通过分析，选取具有代表性的差异蛋白点送至深圳华大基因科技服务有限公司进行质谱鉴定；步骤3、数据处理用DPS 9.50对数据进行统计分析，Microsoft Word 2003绘制表格。