[发明专利]蓝舌病病毒基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种BTV‑2型、3型、4型、7型、12型基因型分型鉴别的多重RT‑PCR试剂盒及其检测方法，用于单管同时鉴别检测蓝舌病病毒2型、3型、4型、7型、12型。本方法根据蓝舌病不同基因型病毒VP2基因序列保守区设计了5对PCR特异性引物，利用GeXP原理合成一对非生物来源的通用引物，在各对特异性引物的上下游分别添加通用引物构成5对特异性嵌合引物，用特异性引物进行反转录，结合通用引物及特异性嵌合引物构建多重PCR。利用优化的多重PCR体系及条件，可单管同时鉴别检测BTV 2型、3型、4型、7型、12型等5种基因型中的一种或多种，对BTV其它型及PPRV、FMDV核酸无特异性扩增，最低检测浓度可达到pg级。本发明建立的方法灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果。

主权项

1.BTV‑2型、3型、4型、7型、12型基因型分型鉴别的多重RT‑PCR试剂盒，其特征是：包括各型反转录引物管、Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。所述各型反转录引物管如下：BTV‑2反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.2的BTV‑2下游引物0.5OD；BTV‑3反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.4的BTV‑3下游引物0.5OD；BTV‑4反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.6的BTV‑4下游引物0.5OD；BTV‑7反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.8的BTV‑7下游引物0.5OD；BTV‑12反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.10的BTV‑12下游引物0.5OD；所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成：DNA序列为SEQ ID NO.11的100μmol/L的通用上游引物0.75μL；DNA序列为SEQ ID NO.12的100μmol/L的通用下游引物0.75μL；DNA序列为SEQ ID NO.13的10μmol/L的BTV‑2特异性嵌合上游引物0.4μL；DNA序列为SEQ ID NO.14的10μmol/L的BTV‑2特异性嵌合下游引物0.4μL；DNA序列为SEQ ID NO.15的10μmol/L的BTV‑3特异性嵌合上游引物0.5μL；DNA序列为SEQ ID NO.16的10μmol/L的BTV‑3特异性嵌合下游引物0.5μL；DNA序列为SEQ ID NO.17的10μmol/L的BTV‑4特异性嵌合上游引物0.35μL；DNA序列为SEQ ID NO.18的10μmol/L的BTV‑4特异性嵌合下游引物0.35μL；DNA序列为SEQ ID NO.19的10μmol/L的BTV‑7特异性嵌合上游引物0.35μL；DNA序列为SEQ ID NO.20的10μmol/L的BTV‑7特异性嵌合下游引物0.35μL；DNA序列为SEQ ID NO.21的10μmol/L的BTV‑12特异性嵌合上游引物0.35μL；DNA序列为SEQ ID NO.22的10μmol/L的BTV‑12特异性嵌合下游引物0.35μL；2X Premix Taq缓冲液12.5μL；灭菌去离子水2.1μL；合计20μL，为单次反应的用量；所述阳性对照管：管内为BTV‑2、BTV‑3、BTV‑4、BTV‑7、BTV‑12阳性重组质粒混合物；所述阴性对照管：管内为无BTV‑2、BTV‑3、BTV‑4、BTV‑7、BTV‑12的牛肉肌肉组织DNA样品；所述灭菌去离子水管：1000μL。