[发明专利]一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法。包括如下步骤，S1、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；S2、将表达外源重编程因子的微环游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；S3、将S2中获取的含有表达外源重编程因子的微环游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得外源重编程因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC。

主权项

1.一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，包括如下步骤，1）、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；2）、将表达外源重编程因子的微环游离型载体导入步骤1）中获取的红细胞祖细胞；3）、将步骤2）中获取的含有表达外源重编程因子的微环游离型载体红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；4）、待完全诱导后，更换步骤3）中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得外源重编程因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC；所述微环游离型载体的制备方法包括如下步骤，S1、用微环DNA亲本质粒转化宿主菌，该宿主菌内含有表达单向位点特异性重组酶的基因，该微环DNA亲本质粒中包含用于诱导红细胞祖细胞成为多能干细胞的外源重编程因子；S2、诱导S1中宿主菌内单向位点特异性重组酶的表达；S3、使S1中的微环DNA亲本质粒与S2中的单向位点特异性重组酶接触，发生位点特异性重组产生微环游离型载体；所述外源重编程因子选自蝾螈OCT4转录因子和其他转录因子，其他转录因子选自NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53 knockdown、MIR302/367 cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。