[发明专利]一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法

摘要

本发明公开了一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法,包括步骤：S1、样品制备及凝胶电泳，在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合，电压80V进行电泳；S2、转膜，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭，将PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min；S4、加一抗，加入一抗，24℃摇床孵育2h，PBST漂洗4次，5min/次；S5、加二抗，加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，PBST漂洗4次，5min/次；S6、显色，将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，进行凝胶显影。本发明在磷酸化蛋白质的免疫印迹检测中采用湿转膜方式，蛋白信号连续且强度高；一抗抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带，蛋白信号效果较好。

主权项

1.一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电压80V进行电泳；S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜，转印夹负极放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入合适比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；S6、显色：使用1mL加样枪将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影。