[发明专利]基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法在审

专利信息
申请号: 201810311126.9 申请日: 2018-04-09
公开(公告)号: CN108728399A 公开(公告)日: 2018-11-02
发明(设计)人: 韩剑众;秦玉梅;王稣嫱 申请(专利权)人: 浙江工商大学
主分类号: C12N5/071 分类号: C12N5/071;A01N1/02;G01N21/64
代理公司: 杭州千克知识产权代理有限公司 33246 代理人: 黎双华
地址: 310018 浙江*** 国省代码: 浙江;33
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摘要: 发明公开了一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法包括:(1)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行分离;(2)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行3D培养,形成类器官;(3)小鼠小肠类器官传代;(4)小鼠小肠类器官冻存;(5)小鼠小肠类器官复苏;(6)小鼠小肠类器官冰冻切片制备;(7)小鼠小肠类器官冰冻切片免疫荧光标记及鉴定。相比于现有技术,本发明以含有干细胞的小肠隐窝为基础,优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基,并包含完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。此方法获得小肠类器官可以反复传代,且传代类器官具有性状稳定性。
搜索关键词: 小鼠 小肠 器官 传代 冻存 复苏 冰冻切片 十二指肠 回肠 空肠 体外 免疫荧光标记 体外培养体系 性状稳定性 小肠隐窝 培养基 干细胞 制备 优化
【主权项】:
1.基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法,其特征在于包括以下几个步骤:步骤一、收集一只8‑10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠,放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中,置于冰上;用眼科镊清除小肠残留肠系膜,将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开,用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜,得到清洗干净的小肠;将清洗完毕的小肠分成三等分,分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段,中间段小肠的中间部4厘米为空肠段,后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段;将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后,用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2‑3次;用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠;用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3‑5毫米的小段,将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗,将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗,将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗,清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10‑15次;清洗完毕后,将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部,然后去除上清液;分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM,pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后,横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40‑50rpm的速度振荡30分钟进行消化;在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM,pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后,横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40‑50rpm的速度振荡45分钟进行消化;将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降,去除上清液;向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后,将离心管1、2和3分别上下颠倒10‑15次进行清洗;步骤二,将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降,去除上清液后,分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液,轻柔振荡50次,脱出小肠碎片中的隐窝,随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后,将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中;采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤,滤液转移至50毫升离心管5中;重复多次,直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时,停止收集;步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟;去除离心管5中的上清液,加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后,得隐窝悬液,移液枪吸取20微升隐窝悬液,滴于载玻片上,倒置显微镜下计数隐窝数量;将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟,去除离心管6中的上清液,得隐窝沉淀,并将隐窝沉淀置于冰上;步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液,用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1;将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中;将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟;待复合凝胶完全聚合后,再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基,每3天更换一次完全培养基,得到初代小肠类器官;步骤五、在步骤四接种后6天,去除步骤四中24孔培养板中培养基,然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上,用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎,得到复合凝胶悬液2;用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出,重复一次,使隐窝类似结构从小肠类器官中释放,得到解离小肠类器官悬液1;将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中,以200g转速和4℃温度下离心10分钟,去除离心管7中上清液;向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150‑250微升冰上预融化的复合凝胶液,用移液枪吹打3‑4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3;将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中;将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟;待复合凝胶完全聚合后,再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基,每3天更换一次完全培养基,得到传代小肠类器官;步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后,将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后,加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上,用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎,得到复合凝胶悬液3;将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中,以200g转速和4℃温度下离心10分钟,去除离心管8中上清液;在离心管8中加入1毫升冻存液后,得小肠类器官重悬液;以2‑3孔小肠类器官重悬液为一组,转移至一根2毫升冻存管中,放于含异丙醇的冻存盒中,‑80℃放置24小时后放入液氮中长期保存,得到冻存小肠类器官;步骤七、将存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出,立即放入37℃水浴锅中速溶,待小肠类器官重悬液完全融化后,转移小肠类器官重悬液到15毫升离心管9中,加入预冷基础培养基至5毫升,在转速200g条件下离心10分钟;去除离心管9的上清液后,加入100微升复合凝胶液,得到小肠类器官复苏重悬液;将小肠类器官复苏重悬液按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板3中;将24孔培养板3置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟;待复合凝胶完全聚合后,再向24孔培养板3的每孔中加入500微升完全培养基,每3天更换一次完全培养基,得到复苏小肠类器官。
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