[发明专利]一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

摘要

本发明提供了一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段；2).构建pTrcHis2c‑katG质粒；3).构建pET28a‑inhA质粒；4).纯化InhA蛋白；5).纯化INH‑NAD化合物。本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成INH‑NAD并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现INH‑NAD的纯化分离。

主权项

1.一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段：1‑1).以SEQ ID №1所示的引物katGBglIIFP和SEQ ID №2所示的引物katGEcoRIRP，进行katG的PCR扩增；以SEQ ID №3所示的引物InhANcoIFP和SEQ ID №4所示的引物InhAHindШRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，‑20℃保存备用；2).构建pTrcHis2c‑katG质粒：2‑1).扩大培养含有pTrcHis2c质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pTrcHis2c质粒；2‑2).将步骤1‑1扩增后回收的katG序列片段和步骤2‑1获得的pTrcHis2c质粒分别都使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的katG序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pTrcHis2c使用T4 DNA连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet‑katG质粒；3).构建pET28a‑inhA质粒：3‑1).扩大培养含有pET28a质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pET28a质粒；3‑2).将步骤1‑1扩增后回收的inhA序列片段和步骤3‑1获得的pET28a质粒分别都使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pET28a使用T4 DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pET28a‑inhA质粒；4).纯化InhA蛋白：4‑1).将pTrcHis2c‑katG质粒和pET28a‑inhA质粒等量混合后共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2‑3小时，然后加入100mg/mL的异烟肼和10mM的MnCl2培养16小时；4‑2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，再超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的Ni2+‑NTA亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的InhA蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mM Tris‑HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mM Tris‑HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0；5).纯化INH‑NAD化合物：5‑1).使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用pH 8.0的50mM Tris‑HCl置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有INH‑NAD。