[发明专利]G蛋白偶联受体87促进JAK/STAT3信号传导的方法

摘要

本发明属于医疗技术领域，公开了一种G蛋白偶联受体87在胰腺导管腺癌中促进JAK/STAT3信号传导的方法，采用细胞培养，组织标本，蛋白质印迹分析，微阵列数据处理和可视化，质粒产生，免疫沉淀，球体形成，流式细胞术分析，肿瘤异种移植物，EMSA实验，统计分析进行实验。本发明表明在PDA中GPR87显着上调，并且与原发性PDA中总体存活较短相关。发现GPR87被STAT3诱导并直接与JAK2结合，导致STAT3的超活化和CSC群体在PDA中的体外和体内增殖。同时通过与JAK2的相互作用将GPR87鉴定为促进PDA中持续STAT3激活的调节剂。这些发现支持了表观遗传事件在癌症进展中的功能和临床意义。

主权项

1.一种G蛋白偶联受体87在胰癌中促进JAK/STAT3信号传导的方法，其特征在于，所述G蛋白偶联受体87在胰腺导管腺癌中促进JAK/STAT3信号传导的方法包括以下步骤：步骤一，细胞培养；步骤二，组织标本；贵州医科大学附属医院提供了2000年至2006年期间收集的121个石蜡包埋的PDA封存标本；样品获自手术切除的肿瘤患者的临床和组织病理学诊断与PDA，并通过病理学检查证实；步骤三，蛋白质印迹分析；使用抗GPR87进行蛋白质印迹分析：抗‑pSTAT3，抗STAT3，抗pJAK2，抗JAK2，抗pTyr‑100；抗Flag和抗HA抗体；将膜剥离并用抗‑α‑肌动蛋白或抗GAPDH抗体重新检测上样对照；步骤四，微阵列数据处理和可视化；从GEO数据库下载微阵列数据；微阵列数据提取在MeV 4.6；GSEA使用GSEA2.0.9进行；步骤五，质粒产生；进行人类GPR87基因的PCR扩增，并将cDNA克隆到pSin EF2慢病毒载体中以表达重组FLAG‑标记的GPR87；截短的JAK2片段也被克隆到pSin EF2中；将靶向GPR87和JAK2的shRNA克隆到pSuper Retro病毒载体中；为了产生萤光素酶报告基因，将3×STAT3应答元件克隆到pTAL Luc载体中；所有在质粒构建中使用的寡核苷酸列于补充方法的寡核苷酸表中；步骤六，免疫沉淀；用含有150mM NaCl，10mM HEPES，pH7.4和1％NP‑40的缓冲液裂解用指定质粒转染的总共3×107个BXPC‑3细胞；然后将裂解物与FLAG亲和琼脂糖在4℃下温育过夜；用免疫沉淀洗涤缓冲液(150mM NaCl，10mM HEPES，pH 7.4,0.1％NP‑40)洗涤含有亲和结合蛋白的珠子7次，用2×200μL1M甘氨酸(pH3.0)洗脱；样品变性，然后通过SDS‑PAGE分辨；步骤七，球体形成；将5×102个细胞接种在6孔超低簇板中，将10或20个细胞接种在24孔超低簇板中；将细胞在补充有2％B27(Invitrogen)，20ng/mL EGF，20ng/mL bFGF(PeproTech)，0.4％BSA(Sigma‑Aldrich)的DMEM/F12无血清培养基(Invitrogen)中培养10天，和5μg/mL胰岛素用于球形成；步骤八，流式细胞术分析；将细胞用胰蛋白酶消化并以1×106个细胞/mL的浓度重悬于含有2％FBS的DMEM中；然后将细胞在存在或不存在100μM维拉帕米(Sigma‑Aldrich)的条件下于37℃预温育30分钟以抑制ABC转运蛋白；随后，将细胞与5μg/mL Hoechst 33342(Sigma‑Aldrich)在37℃孵育90分钟；随后在冰上孵育10分钟并在流式细胞术分析之前用冰冷的PBS洗涤；使用Summit 5.2软件(Beckman Coulter)分析数据；步骤九，肿瘤异种移植物；所有的实验程序均由中山大学的IACUC批准；将裸鼠随机分为六组(每组n＝5)；将指定数目的细胞皮下接种到裸鼠中；接种后31天处死小鼠，切除肿瘤并进行病理学检查；步骤十，EMSA实验；使用来自Pierce Biotechnology的LightShift化学发光EMSA试剂盒进行EMSA；使用含有特异性结合位点的以下DNA探针：STAT3：有义，5'‑TCGACATTTCCCGTAAATC‑3'，反义，5'‑GATTTACGGGAAATGTCGA‑3'；和OCT‑1：有义，5'‑TGTCGAATGCAAATCACTAGAA‑3'，反义，5'‑TTCTAGTGATTTGCATTCGACA‑3'；步骤十一，统计分析。