[发明专利]利用CRISPR-CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法

摘要

本发明提供了一种CRISPR‑CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法，步骤如下：(1)、细胞转染；(2)、细胞基因组提取；(3)、PCR鉴定；(4)、基因水平验证；(5)、蛋白水平验证：在基因水平验证突变细胞株后，用蛋白质免疫印迹(Western blotting)进一步验证K3、K7‑1和K7‑2是KDM2A基因缺陷型。本发明还同时提供了利用上述方法制备的KDM2A基因敲除的HEK293T细胞系及以其作为细胞模型在研究KDM2A甲基化酶所涉及的细胞增殖和凋亡信号通路中的应用。

主权项

1.一种利用CRISPR‑CAS9技术敲除HEK293T细胞中人源KDM2A基因的方法，其特征在于具体的方法如下：（1）、细胞转染：培养HEK293T细胞至70～90%汇合度时准备转染，将含有表达载体pX458‑KDM2A的混合液加入HEK293T细胞中进行转染，然后培养；所述表达载体pX458‑KDM2A的构建方法为：在14号外显子以及18号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，依次构成序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，将序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO：3，以及SEQ ID NO.2和SEQ ID NO：4所形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，从而制得表达载体pX458‑KDM2A；所述14号外显子上的靶序列为：5’‑ACATCGCACTCGTCTCCGTC‑3’，18号外显子上的靶序列为：5’‑TTTGAAGCGCTCATCGCGGC‑3’；（2）、细胞基因组提取：将转染后的HEK293T细胞进行基因组提取；（3）、PCR鉴定：根据KDM2A基因序列，设计引物KDM2A‑3F和KDM2A‑3R、KDM2A‑7F和KDM2A‑7R，上述引物的序列分别如：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；利用上述引物对所提取的基因组进行PCR反应；（4）、基因水平验证：将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定得到突变细胞株；（5）、蛋白水平验证：在基因水平验证突变细胞株后，用蛋白质免疫印迹进一步验证上述突变细胞株是KDM2A基因缺陷型。