[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用

摘要

本发明提供通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中敲除bcaP基因，得到地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP，相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了11％以上。

主权项

1.一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒 T2(2)‑ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)‑ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)‑ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)‑ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)‑ori‑bcaP；（5）将bcaP基因敲除质粒T2(2)‑ori‑bcaP转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcaP基因的上游臂或bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除bcaP基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP；其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的bcaP基因为SEQUENCE LISTING中所示。