[发明专利]ATP硫酸化酶活性的检测方法

摘要

本申请公开了一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸分别和腺苷5’三磷酸、荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入ATP硫酸化酶；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的PPi，测得对应的FPPi，生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶活性参数；(8)判断ATP硫酸化酶活性。采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性。

主权项

1.一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷5’三磷酸APS、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，则测试样品池发生酶促反应：根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k+表示ATP sulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k‑‑表示ATP sulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；kcat表示ATP sulfurylase对PPi的催化速率；(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的PPi荧光强度FPPi，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α9：在线性区间:[ATP]＝α9FATP,[ATP]表示ATP的浓度；FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度；所述荧光强度时间曲线在起始点的导数即可换算成该PPi浓度对应的反应速率：t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；基于终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度，不同浓度PPi存在对应的反应速率，以PPi浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出PPi浓度所述对应的VPPi，连接这些点，制作得到米氏曲线；(7)求出Vmax：根据米氏公式：其中，[PPi]表示PPi的浓度，Vmax表示最大速率，KM表示米氏常数；拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶的活性参数。