[发明专利]通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法

摘要

本发明公开了一种通过miRNA let‑7b调控GHR基因表达的方法，包括以下步骤：1)pcDNA3.1‑EGFP‑pre‑let‑7b表达质粒的构建；2)pmirGLO‑let‑7b‑GHR 3'UTR表达质粒的构建；3)萤火虫/海肾双荧光素酶报告系统进行靶标验证。本发明提供的GHR基因表达的调控方法，通过将let‑7b过表达载体转染DF‑1细胞后，降低了GHR的蛋白质表达量，有效使得荧光素酶相对活性明显下降，从而调控GHR基因表达。

主权项

1.通过miRNA let‑7b调控GHR基因表达的方法，其特征在于包括以下步骤：1‑1)使用序列如SEQ ID № 1和2所示的引物扩增let‑7b所在的基因组，经电泳分离后回收目的片段；1‑2)将PCR所得的目的片段与载体pEASY‑T1连接，并且转化至感受态细胞进行单克隆培养；1‑3)抽提质粒，并且分别用NotⅠ与ApaⅠ酶切pcDNA3.1‑EGFP质粒载体和前体miRNA及其侧翼序列的T克隆载体pEASY‑T1‑pre‑let‑7b，37℃温育5h；1‑4)电泳pcDNA3.1‑EGFP和pEASY‑T1‑pre‑let‑7b质粒载体的酶切产物，回收电泳酶切片段；将pcDNA3.1‑EGFP质粒双酶切回收片段、pre‑let‑7b及其侧翼序列的双酶切回收产物，进行连接，轻轻混匀后16℃连接过夜，得到pcDNA3.1‑EGFP‑pre‑let‑7b表达质粒；2‑1)使用序列如SEQ ID № 3和4所示的引物扩增GHR基因，经电泳分离后回收目的片段；2‑2)将PCR所得的目的片段与载体pEASY‑T1连接，并且转化至感受态细胞进行单克隆培养；2‑3)抽提质粒，并且分别用SacI，XbaI双酶切pmirGLO质粒载体以及靶基因3'UTR序列的T克隆载体pEASY‑let‑7b‑GHR，37℃温育5h；2‑4)；电泳pmirGLO和pEASY‑let‑7b‑GHR质粒载体的酶切产物，回收电泳酶切片段；将pmirGLO质粒线性化回收片段与靶基因3'UTR序列的T载体双酶切回收产物，进行连接，轻轻混匀后16℃连接过夜，得到pmirGLO‑let‑7b‑GHR 3'UTR表达质粒；3‑1)将来源于ELL鸡胚胎的DF‑1细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中；3‑2)将靶基因GHR的3'UTR靶序列插入到萤火虫荧光素酶基因下游，载体pcDNA‑EGFP‑pre‑let‑7b分别与载体pmirGLO‑let‑7b‑GHR 3'UTR共转染到DF‑1细胞中，并分别设置空质粒载体与let‑7b表达载体共转染对照。