[发明专利]一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法

摘要

本发明涉及一种犬瘟热病毒的可视化快速检测方法，融合了免疫层析技术和分子生物学手段，结合LAMP扩增效率高和横向测流试纸条便于观察结果，使检测结果更具有直观性，具有可视化、快速诊断、准确等特点，解决传统检测方法操作繁琐、敏感性、特异性低的缺陷，本发明检测方法适用于临床诊断、食品安全和动物疾病检测等领域。

主权项

1.一种犬瘟热病毒的可视化快速检测方法，包括以下步骤：1）引物设计根据GenBank中收录的CDV基因序列，利用DNAMAN软件进行对比与分析，筛选出N基因序列中同源性相对较高的保守区，利用软件Primer Explore 5针对靶基因在线设计6条引物：F3     CCCAAGCATCAACTCTGT；B3     ATTGCTCAGCATCATCAAC；FIP    CAAGCATCAACTCTGTTTG‑GCCTCAGAATCCAAACTTG；BIP    CTTATTCTCCAACCAGCCT‑TTGAGCTTTCGACCCTTC；LF     GTCTTACGTTTGCATCCAG；LB     AAGCTCAAGGGCAATTAGG；其中，引物LF上标记生物素（Biotin）,引物LB上标记异硫氰酸荧光素；2）病毒总RNA的提取取实验室培养的犬瘟热病毒细胞培养液，按照病毒基因组DNA/RNA提取病毒总RNA；3）RT‑LAMP反应：根据上述的6条引物，以病毒总RNA为模板进行RT‑LAMP反应，得到扩增产物；反应体系为：25µL扩增体系由2.5µL 10×Amplification buffer、3.5µL 10mM dNTP、2µL 0.8µM FIP引物、2µL 0.8µM BIP引物、1µL 0.4µM LF引物、1µL 0.4µM LB引物、0.5µL 0.1µM F3引物、0.5µL 0.1µM B3引物、1µL 8U Bst聚合酶、1µL 0.2M甜菜碱、2µL 8mM MgSO4、0.5µL 5U AMV反转录酶、3µL样品RNA、4.5µL灭菌超纯水；4）反应条件：将上述混合液置于水浴锅中，反应温度设置为60℃1h，80℃2min终止反应；5）结果显示：将经过扩增的PCR管冷却后放入检测装置内芯中，合上检测装置内芯，将装置内芯放入检测装置外壳完全密闭；将装置放在水平台上，5分钟内读取结果；若试纸条出现两条红色条带，结果表明样本中含有待检测的核酸片段，若试纸条质控区（C线）出现一条红色条带，结果表明样本中不含目的核酸，若均未出现红色条带，结果表明此试纸条无效。