[发明专利]一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用在审
| 申请号： | 201810358782.4 | 申请日： | 2018-04-20 |
| 公开（公告）号： | CN108531652A | 公开（公告）日： | 2018-09-14 |
| 发明（设计）人： | 袁小远;王友令;于可响;孟凯;张玉霞;艾武;亓丽红 | 申请（专利权）人： | 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 济南泉城专利商标事务所 37218 | 代理人： | 李桂存 |
| 地址： | 250000 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用。具体步骤为：（1）病毒核酸的提取和反转录；（2）进行PCR反应，连接pMD‑18T载体，转化感受态DH5α，随后进行阳性转化菌的检测，提取阳性重组菌质粒，测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线；（3）标准品建立的标准曲线。通过本发明制备的标准品，能够对水禽重要疫病定量检测，可计算待测样品模板的初始浓度，即样本中的病毒含量，适用于规模化饲养场水禽重大疫病的早期快速诊断，能给生产提供有效防治信息，及时降低上述疾病的发病率和死淘率，能够有效增加养殖户的增收，具有良好的经济效益和社会效益。 | ||
| 搜索关键词： | 水禽 感受态DH5 α 疫病 质粒 制备 定量检测标准 标准曲线 标准品 生物检测技术 病毒核酸 待测样品 定量检测 快速诊断 有效防治 反转录 规模化 饲养场 养殖户 重组菌 稀释 转化 发病率 应用 样本 病毒 疾病 检测 制作 生产 | ||
【主权项】：
1.一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）病毒核酸的提取和反转录:（2）进行PCR反应，然后阳性PCR产物回收后连接pMD‑18T载体，转化感受态DH5α，随后进行阳性转化菌的检测，提取阳性重组菌质粒，测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线，标准质粒拷贝数计算公式如下： Copy Number=质量/分子量×6.02×1023= X 6.02×1023 / (载体长度+片段长度)/bp×109×660 ；（3）标准品建立的标准曲线构建的阳性质粒进行10倍稀释，qPCR扩增反应后，将阳性重组质粒进行10倍系列稀释，三种质粒终浓度调整为4.39×109～4.39×10 Copies/μL、4.20×109～4.20×10 Copies/μL、2.91×109～2.91×10 Copies/μL，共9个稀释度，以ddH2O为阴性对照，建立标准曲线，每个稀释度均设5个重复。
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