[发明专利]一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法

摘要

本发明提供了一种有效制备羊梭菌病基因重组亚单位疫苗的方法。本发明使用基因优化后的重组蛋白，避免了野生型可溶性毒素蛋白对动物的毒性，不需要经过重组蛋白的灭活，在保证了疫苗抗原安全性的同时，尽可能地保证了疫苗抗原的最大免疫原性。

主权项

1.一种制备羊三联四防基因重组亚单位疫苗的方法，通过原核表达相关毒素蛋白，和适当的佐剂配成疫苗，接种免疫实验动物进行效果评价，其特征在于通过以下步骤完成：1）分别克隆产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因（Cpa 741‑1110 nt），腐败梭菌α毒素蛋白基因(Csa 96‑1320 nt)，产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因（Cpb 84‑1008 nt），产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因（Etx106 99‑1002 nt，对应氨基酸106位H突变为P），以上毒素抗原N端分别携带flagellin、invasin 、flagellin和padre佐剂并克隆至本公司改造的图1A表达载体，得到四种重组表达质粒示意图见图1B；2）将构建好的4个重组质粒载体分别转化低内毒素大肠杆菌表达菌株ClearColi® BL21(DE3) ，获得基因工程菌株；3）将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，将培养后的工程菌使用高压均质机破菌，离心分离上清，使用亲和纯化方法纯化目的蛋白；4）纯化后的几种目的蛋白使用TritonX‑114 处理内毒素并过滤除菌，保存于适当缓冲液；5）使用内标法进行重组蛋白定量；6）按照一定的比例混合（1:1:1:1）4种重组蛋白并与佐剂等体积乳化配苗；7）将配好的疫苗免疫家兔进行安全性评价检测；8）将配好的疫苗免疫家兔一段时间后采血分离血清，取分离的血清分别和不同剂量4种野生型毒素进行中和实验，后注射小鼠，观察小鼠存活情况，评价疫苗效力。