[发明专利]一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法

摘要

本发明公开了一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法。本发明所提供的方法是基于重叠延伸PCR高通量对目标基因片段多位点高效引入突变的方法；所用引物不是简并引物，而是准确设计目标突变序列的突变引物；突变位点长度不限于单个氨基酸，可设计为连续1‑5个氨基酸；引物非单条分开合成，而是由寡核苷酸合成仪在集成芯片上批量合成，引物种类量级可达104‑105种类/批次；本发明所述突变方法可通过调节反应条件在一定程度上实现对突变频率的控制。本发明的突变建库方法可获得较高比例的有效突变体，建库突变体阳性率(非同义氨基酸突变)可达～80％；本发明所建的突变体库经过后续高通量筛选成为获得理想蛋白质及核酸改造体的有力工具。

主权项

1.一种高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法，包括如下步骤：(1)根据目标片段DNA的序列，针对每个预突变位点及其对应的预突变结果分别设计单链寡核苷酸片段；所述单链寡核苷酸片段自5’端到3’端依次由上游接头序列、内切酶M的正向识别序列、突变引物、所述内切酶M的反向识别序列和下游接头序列组成；所述突变引物由对应于所述预突变位点的突变序列和位于所述目标片段DNA上所述预突变位点两侧的同源序列组成；(2)合成步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库；(3)以步骤(2)所得的混合ssDNA文库为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对进行PCR扩增，然后采用所述内切酶M对所得PCR产物进行酶切处理，获得短双链突变引物文库；(4)利用所述目标片段DNA的全长上游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDown PCR，扩增20‑25个循环后得到一组产物，记为产物A；利用所述目标片段DNA的全长下游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDown PCR，扩增20‑25个循环后得到另一组产物，记为产物B；将所述产物A和所述产物B混合后继续进行5‑10个循环的第二轮TouchDown PCR，得到终产物；所述终产物中的DNA片段与所述目标片段DNA相比已被引入多位点突变。