[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法

摘要

本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，包括基因敲除和多拷贝整合两方面：1.在敲除一些影响生长的基因时，首先利用pk18mobsacB质粒进行第一轮同源重组，然后利用CRISPR/Cpf1对基因组的双链切割作为筛选压力，选择正确发生第二次同源重组的菌株，保证了获得正确敲除菌株的效率；2.在进行基因多拷贝整合时，通过特殊同源序列设计原理，使得第一轮同源重组时pk18mobsacB插入到基因组上Cpf1作用位点，破坏PAM结构而导致CRISPR/Cpf1不对基因组发生切割作用，保证目标基因的特异性整合，如果整合到已有拷贝的序列或其他位点时，crRNA能够识别设计的切割序列从而引导Cpf1进行双链切断，导致菌株无法存活。

主权项

1.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：(1)敲除质粒构建：以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△aroE‑1，△aroE‑2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE‑3，△aroE‑4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE‑1，△aroE‑4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl‑△aroE；(2)切割质粒构建：通过CHOPCHOP设计aroE切割序列，从而设计切割所需crRNA序列：首先将质粒pXMJ19中的氯霉素抗性基因换成奇霉素抗性基因；然后用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到aroE切割质粒pXMJ19Cmr∷sper‑cpf1‑crRNA‑△aroE；(3)敲除aroE目的菌株的获得：将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl‑△aroE电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中，挑在卡那霉素抗性平板能正常生长的单菌落，以特异性鉴定引物△aroE‑5，△aroE‑6，△aroE‑7，△aroE‑8进行菌落PCR，条带大小正确的菌，接种于带有卡那霉素抗性的摇管里培养，得到13032△aroE单交换菌，将这个菌也制作成感受态，然后将切割质粒pXMJ19Cmr∷spercpf1crRNA‑△aroE电转化到感受态细胞中，涂布于奇霉素抗性和链霉素抗性的平板，长出单菌落后以△aroE‑1，△aroE‑4为引物进行菌落PCR验证，条带正确的菌接摇管；经测序所得敲除菌株13032△aroE序列为序列表中序列23所示序列。