[发明专利]乳汁中表达GP5-M蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法

摘要

本发明公开了乳汁中表达GP5‑M融合蛋白的羊乳腺生物反应器的制备方法，制备GP5‑M融合表达的基因打靶载体，敲入奶山羊β‑乳球蛋白第一外显子上，筛选中靶细胞，利用体细胞核移植技术制备转基因奶山羊，通过乳腺生物反应器生产含有GP5‑M融合蛋白的乳汁，从乳汁中分离纯化GP5‑M融合蛋白，添加佐剂制备基因工程亚单位疫苗，达到防控PRRS的目的。

主权项

1.乳汁中表达GP5‑M融合蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建基因打靶载体pBT‑GP5‑Ma、参照GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV美洲型代表株VR2332的GP5和M蛋白基因序列，设计并合成引物；用RT‑PCR方法分别扩增出PRRSV野毒株GP5和M蛋白基因片段，利用GP linker将两个基因连接起来，同时添加his标签和BGHpA组成GP5‑M基因；b、以克隆山羊β乳球蛋白基因CDS区上游810bp同源序列SEQ ID NO:10和下游715bp同源序列SEQ ID NO:11，分别作为5’端和3’端同源臂，构建基因打靶载体pBT‑GP5‑M；(2)打靶载体pBT‑GP5‑M转染山羊胎儿成纤维细胞将1‑3代的山羊胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到80％汇合时，将打靶载体pBT‑GP5‑M和TALEN载体共同导入山羊胎儿成纤维细胞，筛选出中靶细胞进行接种并扩大培养；(3)中靶细胞的PCR鉴定对中靶细胞进行PCR鉴定，确认中靶细胞克隆；对中靶细胞克隆进行染色体分析，将染色体数正常比例大于70％的中靶细胞克隆用于核移植，制备转基因奶山羊；(4)转GP5‑M基因克隆奶山羊的制备将步骤(3)得到的所述中靶细胞100％汇合后，核移植到去核后的卵母细胞中；放入融合液，再进行融合形成重组胚胎；将所述重组胚胎植入同步发情的受体羊输卵管中，得到转基因克隆羊；(5)转基因克隆奶山羊的检测提取出生小羊血液基因组DNA，进行PCR检测，结果表达打靶载体正确插入山羊β‑乳球蛋白基因座第一外显子上，且读码框正确。