[发明专利]一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法

摘要

本发明属于蛋白参数分析领域并公开了一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，包括血清蛋白细胞的采集、血清细胞内蛋白的提取、蛋白参数液相质谱法分析；本发明方法先通过采集血清蛋白细胞，然后提取出血清细胞内蛋白，最后通过液相色谱法测试血清细胞内蛋白的参数，将血清细胞内蛋白的参数准确、定量、定性的测试出来，本发明方法检测，测试的结果准确，具有十分可靠的指导意义，有效对煤矿工人进行尘肺病预防诊断。

主权项

1.一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本8‑10ml；然后将采集的血清样本在2000‑6000rpm、3‑5℃条件下进行离心2‑5min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在2000‑6000rpm、3‑5℃条件下再次离心2‑5min；最后，将收集到的下层细胞在‑60‑ ‑80℃深冷环境下冷冻干燥2‑8h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入0.4‑1.2mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入4‑20μL质量比为2‑6:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，3‑5℃温度下静置反应10‑30min；接着，加入5‑15μL浓度为70‑130mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，3‑5℃温度下静置1‑3h；最后，在8000‑10000rpm下离心40‑60min，取上清液，得到蛋白溶液；②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积4‑6倍温度为的‑10℃‑ ‑50℃的二甲基酮水溶液，沉淀10‑24h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为‑10℃‑ ‑50℃体积浓度为70%‑85%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，‑80℃贮存得到干燥蛋白；④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加20‑60μL浓度为40‑60mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入1‑4μL的2‑羧乙基磷酸在50‑60℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入2‑4μL的甲基硫代磺酸甲酯反应10‑15min；最后，继续加入浓度为0.2‑0.3μg/μL的蛋白酶水溶液20‑30μL，36‑38℃反应10‑20h，进行蛋白酶解；⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用60‑80μL乙醇溶解后的iTRAQ标记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。