[发明专利]一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因VH、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；以步骤(2)的第一扩增产物为模板；使用Linker‑r和Linker‑s以及带有限制性酶切位点的VH上游引物、所述扩增VH的下游引物再次扩增VH；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增kappa链的上游引物、带有限制性酶切位点的kappa链下游引物再次扩增kappa链；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增lambda链的上游引物、带有限制性酶切位点的lambda链下游引物再次扩增lambda链；得到第二扩增产物；使用带有限制性酶切位点的连接引物将第二扩增产物中的VH、kappa链和lambda链拼接成scFv基因库。

主权项

1.一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因VH、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；其中，扩增VH的上游引物为：第一VH上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：5’‑CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG‑3’；第二VH上游引物，序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：5’‑CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG‑3’；第三VH上游引物，序列如SEQ ID NO:3所示，具体为：5’‑GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG‑3’；第四VH上游引物，序列如SEQ ID NO:4所示，具体为：5’‑CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG‑3’；第五VH上游引物，序列如SEQ ID NO:5所示，具体为：5’‑GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC‑3’；第六VH上游引物，序列如SEQ ID NO:6所示，具体为：5’‑CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG‑3’；扩增VH的下游引物为：第一VH下游引物，序列如SEQ ID NO:7所示，具体为：5’‑CGCCTCCACC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC‑3’；第二VH下游引物，序列如SEQ ID NO:8所示，具体为：5’‑CGCCTCCACC TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC‑3’；第三VH下游引物，序列如SEQ ID NO:9所示，具体为：5’‑CGCCTCCACC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC‑3’；第四VH下游引物，序列如SEQ ID NO:10所示，具体为：5’‑CGCCTCCACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC‑3’；扩增kappa链的上游引物为：第一kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:11所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC‑3’；第二kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:12所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC‑3’；第三kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:13所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CC‑3’；第四kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:14所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC‑3’；第五kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:15所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC‑3’；第六kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:16所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC‑3’；扩增kappa链的下游引物为：第一kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:17所示，具体为：5’‑ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC‑3；第二kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:18所示，具体为：5’‑ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC‑3’；第三kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:19所示，具体为：5’‑ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC‑3’；第四kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:20所示，具体为：5’‑ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC‑3’；第五kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:21所示，具体为：5’‑ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC‑3’；扩增lambda链的上游引物为：第一lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:22所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG CAG TCT GTG TTG ACG CAG CCG CC‑3’；第二lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:23所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG CAG TCT GCC CTG ACT CAG CCT GC‑3’；第三lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:24所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG TCC TAT GTG CTG ACT CAG CCA CC‑3’；第四lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:25所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC‑3’；第五lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:26所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG CAG CCT GTG CTG ACT CAR YC‑3’；第六lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:27所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG CAG GCT GTG CTC ACT CAG CCG TC‑3’；第七lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:28所示，具体为：5’‑TGGCGGATCG AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA‑3’；扩增lambda链的下游引物为：第一lambda链下游引物，序列如SEQ ID NO:29所示，具体为：5’‑ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC‑3’；第二lambda链下游引物，序列如SEQ ID NO:30所示，具体为：5’‑ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC‑3’；第三lambda链下游引物，序列如SEQ ID NO:31所示，具体为：5’‑GAG GAC GGT CAG CTG GGT GC‑3’；(3)以步骤(2)的第一扩增产物为模板；使用Linker‑r和Linker‑s以及带有限制性酶切位点的VH上游引物、所述扩增VH的下游引物再次扩增VH；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增kappa链的上游引物、带有限制性酶切位点的kappa链下游引物再次扩增kappa链；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增lambda链的上游引物、带有限制性酶切位点的lambda链下游引物再次扩增lambda链；得到第二扩增产物；使用带有限制性酶切位点的连接引物将第二扩增产物中的VH、kappa链和lambda链拼接成scFv基因库；scFv其中，带有限制性酶切位点的VH上游引物Linker引物为：第一带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQ ID NO:32所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG‑3’；第二带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQ ID NO:33所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG‑3’；第三带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQ ID NO:34所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG‑3’；第四带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQ ID NO:35所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG‑3’；第五带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQ ID NO:36所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC‑3’；第六带有限制性酶切位点的VH上游引物，序列如SEQ ID NO:37所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG‑3’；Linker‑r序列如SEQ ID NO:38所示，具体为：5’‑CGA TCC GCC ACC GCC AGA ACC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC‑3’；所述带有限制性酶切位点的kappa链下游引物为：第一带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:39所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC‑3’；第二带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:40所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC‑3’；第三带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:41所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC‑3’；第四带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:42所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC‑3’；第五带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:43所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC‑3’；Linker‑s的序列如SEQ ID NO:44所示，具体为：5’‑GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGT TCT GGC GGT GGC GGA TCG‑3’；带有限制性酶切位点的lambda链下游引物为：第一带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQ ID NO:45所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC‑3’；第二带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQ ID NO:46所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC‑3’；第三带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQ ID NO:47所示，具体为：5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC GAG GAC GGT CAG CTG GGT GC‑3’；带有限制性酶切位点的连接引物的上游引物序列如SEQ ID NO:48所示，具体为：5’‑GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC‑3’；带有限制性酶切位点的连接引物的下游引物序列如SEQ ID NO:49所示，具体为5’‑GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC‑3’。(4)使用限制性内切酶Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切scFv基因库和使用所述限制性内切酶酶切噬粒载体，连接酶切后的scFv基因库和酶切后的噬粒载体；(5)将步骤(4)的连接产物电转化宿主细胞，得到scFv基因库；(6)培养转入了连接产物的宿主细胞，并得到scFv噬菌体抗体库；(7)靶标噬菌体抗体的筛选和富集。