[发明专利]检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法

摘要

本发明检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法是使用高效液相色谱仪和DVD检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱仪和DVD检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中氯硝西泮相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度，本发明血清经沉淀离心后直接进样，使检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的氯硝西泮血药浓度进行监测。

主权项

1.一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定首先用移液枪将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、10μL标准内标液和190μL空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000‑2000rpm下涡旋混匀30s‑1min后，加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200‑2000rpm下涡旋混匀2‑4min后，再在转速10000‑15000rpm下高速离心4‑6min后，得到上清液，分别取上述上清液200uL，用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氯硝西泮色谱图和2‑萘酚色谱图，以上述至少三个标准溶液的氯硝西泮峰面积与2‑萘酚峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有氯硝西泮的浓度与标准内标液中含有2‑萘酚浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b，标准工作液是含有氯硝西泮的溶液，标准内标液是含有2‑萘酚的溶液；(a)标准工作液的配制：精确称取氯硝西泮标准品1.58mg置于2mL容量瓶中，用2mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，其氯硝西泮的浓度为790ug/mL，将标准储备液A用含水量为10％‑40％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，分别在含有200‑4000ng/mL氯硝西泮的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在‑80℃条件下保存；(b)标准内标液的配制精确称取2‑萘酚标准品2.04mg于2mL试管中，用2mL甲醇进行溶解，得到内标储备液B，其2‑萘酚浓度为1020ug/L，将内标储备液B用含水量为10％‑40％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，得到含有2‑萘酚浓度为50ug/L的标准内标液，并在‑80℃条件下保存，(二)检测血液的离心取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(c)用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10uL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的200uL的血清于上述离心管中，在离心速度为1500‑2500rpm下离心30s‑1min；然后在上述离心管中加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200‑2000rpm下涡旋混匀2‑4min后，再在转速10000‑15000rpm下高速离心4‑6min后，得到上清液即为待测样品；(四)待测样品的检测移取步骤(c)待测样品200uL，使用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的氯硝西泮色谱图和2‑萘酚色谱图，将上述色谱图中的氯硝西泮峰面积和2‑萘酚峰面积之比y代入上述步骤(一)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中氯硝西泮浓度与标准内标液中2‑萘酚浓度之比x，标准内标液中2‑萘酚浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。