[发明专利]引物5’端反向互补的荧光PCR

摘要

引物5'端反向互补的荧光PCR，属于分子生物学‑核酸扩增技术领域，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，在常规PCR指数放大10^9‑12基础上再增加灵敏度50倍，或同样灵敏度情况下可少扩增5个循环；另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性或少扩增5个循环可避开引物非特异扩增区。联合中部同序与3'最末端倒数第1‑2个碱基A腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油密闭使PCR反应循环内无引物二聚体PD产生及杜绝产物气雾胶交叉污染。

主权项

1.引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端间也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，以＞2n级数放大策略而增敏；另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性，联合3'最末端倒数第1‑2个碱基A/a腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油封闭来杜绝产物尤其引物二聚体PD气雾胶污染，具有如以下技术途径：(1)一对引物5'端均加上一段短于引物长度2‑5b的反向5‑10b互补人工序列，根据扩增产物链3'末端与引物互补并而为下一轮循环反应模板的现象，一对5'互补引物扩增产物链3'末端间相应地也互相互补，扩增产物3'末端不仅为后续循环结合引物的模板，产物3'末端人工序列间也可以互为模板、互为引物结合、延伸，放大效率超过＞2n指数或几何级数，实现增强PCR扩增灵敏度；(2)利用引物5'自身的序列作为“人工互补序列”，将一条引物5'端序列对应的5‑8b反向互补序列按5'‑3'方向加到另一条引物5'端前面，反之，另一条引物5'端的反向互补序列加一段至对应引物5'前面，形成两段连续5'反向互补序列而增敏，原引物与添加序列共用了一段引物5'自身序列，原引物序列与添加的序列间可插入一短4b序列限制酶切位点，使增敏PCR产物酶切后长度一致以便于电泳回收和有助于降解PD产物污染。