[发明专利]多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法在审
申请号: | 201810552921.7 | 申请日: | 2018-05-31 |
公开(公告)号: | CN108753930A | 公开(公告)日: | 2018-11-06 |
发明(设计)人: | 刘健刚 | 申请(专利权)人: | 刘健刚 |
主分类号: | C12Q1/6851 | 分类号: | C12Q1/6851;C12Q1/14;C12Q1/10;C12R1/445;C12R1/01;C12R1/46;C12R1/19;C12R1/38;C12R1/22 |
代理公司: | 成都帝鹏知识产权代理事务所(普通合伙) 51265 | 代理人: | 黎照西 |
地址: | 518000 *** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | 本发明提供了一种多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法,属于分子生物学技术领域。该方法采用多重荧光PCR技术对颅内外科手术发热病人脑脊液进行检测,实现了对多种常见颅内感染细菌进行分型检测。本发明的方法可实现快速检测术后颅内是否有细菌感染,能够快速鉴定外科手术后颅内感染患者常见的细菌类型,并解决了培养法不能鉴定新菌种和无法培养细菌的问题,其检测方法特异性和灵敏度高,降低了PCR检测的假阳性,缩短了检测周期,能够及早快速诊断颅内细菌感染,对于阻断临床感染和指导用药具有显著意义。 | ||
搜索关键词: | 细菌感染 颅内 快速检测 术后 多重实时荧光PCR 检测 细菌 分子生物学技术 多重荧光PCR 内外科手术 分型检测 快速鉴定 快速诊断 颅内感染 细菌类型 灵敏度 感染 外科手术 假阳性 脑脊液 新菌种 后颅 发热 | ||
【主权项】:
1.一种多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)提取病原菌样本的菌株混合DNA;(2)配制荧光定量PCR反应液:Mg2+4mM、dNTP 0.3mM、10×Hot Start PCRbuffer、上下游引物各200nM、探针100nM、Hot Start Taq DNAPloymerase 3.5U;然后用EcoR I和DNase I酶切处理反应液;(3)选取以下三组反应液对病原菌样本的菌株混合DNA模板进行荧光定量PCR检测;第一组反应液中,引物和探针序列为:上游引物:5’‑AYAAACYGGAGGAAGGTG‑3’,下游引物:5’‑GATCCAARCGCARRTTCCG‑3’;探针:G+探针:5’‑FAM‑TCAAATCATCATGCCCC‑MGB,G-探针:5’‑VIC‑ATCATGGCCCTTACGACC‑MGB;第二组反应液中,包括以下三对引物和探针:Ⅰ)上游引物:5’‑ATTTATTACAATTAACGAAATGGGCA‑3’,下游引物:5’‑CAACACCCTGAACTTCACC‑3’,探针:5’‑FAM‑ATTAACTGGATGGTACGCGCGAAGAATCGC‑BHQ1‑3’;Ⅱ)上游引物:5’‑TGGGTAGCGGAGAAATTCCAA‑3’,下游引物:5’‑AGTCCAAACAGTGCTCTACCTCCA‑3’,探针:5’‑JOE‑CGCAGCGAAAGCGAGTCTGAATAGGG‑BHQ1‑3’;Ⅲ)上游引物:5’‑ACTCTTACGCAATCTAGCAGATG‑3’,下游引物:5’‑TGCAATACTCGTGCGTTTTAA‑3’,探针:5’‑TexasRed‑CGAAAACGCTTGATACAGGGAGTTT‑BHQ2‑3’;第三组反应液中,包括以下四对引物和探针:Ⅳ)上游引物:5’‑TCCTGCTGATTGACGATCACCC‑3’,下游引物:5’‑CCAGCGTTTCCAGACCGTTCAT‑3’,探针:5’‑JOE‑CCAGATATCACCGTGGTTGGCGAA‑BHQ1‑3’;Ⅴ)上游引物:5’‑CGACGCCTGAAGCGTGACGAAC‑3’,下游引物:5’‑GGCTTGGTGATGTAGTCG‑3’,探针:5’‑FAM‑CATGCTCACCGCCAAGG‑BHQ1‑3’;Ⅵ)上游引物:5’‑CTGATAGTTGAAGACGAACCCGT‑3’,下游引物:5’‑AAATGTCGCAAATCATCAGGTCC‑3’,探针:5’‑TexasRed‑TGGCTGACCTCGCTGGGAGCAA‑BHQ2‑3’;Ⅶ)上游引物:5’‑GGGCGAAGAAGCAATTGCT‑3’,下游引物:5’‑GCGAGGCCGCTTACAGCAATG‑3’,探针:5’‑CY5‑CATCGGTGGCGTAGAAACAAC–BHQ3‑3’;所述荧光定量PCR检测的步骤为:1)先用第一组反应液对混合DNA模板进行PCR检测;2)再采用第二组反应液和第三组反应液,按任意先后次序或同时对混合DNA模板进行PCR检测。
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