[发明专利]一种DAO蛋白的制备和纯化方法及其应用

摘要

本发明提出了一种DAO蛋白的制备和纯化方法，包括以下步骤：步骤一、质粒制备；步骤二、蛋白质的表达；步骤三、蛋白质的纯化。所述DAO‑6H的分子量为38kDa，经由Western blotting分析，利用anti‑His抗体侦测发现，DAO‑6H具可溶部份可供纯化。本发明制备的DAO蛋白是精神分裂症中有重要影响的蛋白，其制备和纯化可用于精神分裂症病理的一系列研究中，有助于现代医学对于精神病症的深入研究，对攻克该系列疾病提供了方法。

主权项

1.一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、质粒制备：以cDNA为模板，加入引物进行PCR，进行30次循环后，以Pro‑Taq将DAO基因扩增后，将DAO经过酶NdeI与XhoI处理后将其接入pET23a(+)质粒中，通过琼脂凝胶体电泳分析和DNA胶体片段纯化，得到纯化后的PCR产物，以限制酶NdeI及XhoI处理纯化过后的DAO片段与pET23a(+)载体，使得DAO‑6H有可与pET23a(+)互补的回文序列，以琼脂胶将载体和DAO片段自胶体纯化，并以限制酶HindIII及BamHI处理纯化，加入连接酶及缓冲液于25℃下反应2小时，使DAO接合入pET23a(+)载体中，接着转化入大肠杆菌Top10F’，于37℃培养至隔日，并以菌落PCR法确认连接成功之后将菌落挑起送测序公司测序，确认序列正确无误后即完成质粒制备，完成质粒制备后即大肠杆菌TOP10F’大量表达带有His‑tag的DAO‑6H；步骤二、蛋白质的表达：将表达DAO‑6H的质粒转入大肠杆菌感受态细胞菌株，挑取单一颗菌落培养于LB培养液中，且于培养液中外加氨苄西林和氯霉素，于37℃隔夜培养后，从培养液中取出0.5ml加入5ml新鲜的LB于37℃培养，当菌体浓度达到OD600至0.4‑0.6时，将温度维持于25℃，外加最终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷，隔夜培养后，取出1ml菌体于4℃下以离心，去除上清液之后加入适量的PBS，超声破碎仪将细胞壁打破，离心之后分离出可溶物与不可溶物；步骤三、蛋白质的纯化：将表达DAO‑6H蛋白的大肠杆菌溶于结合缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，再以超声破碎仪震破细胞，于4℃，以离心20分钟移除细胞碎片，过滤上清液，将此上清液注入已事先通过结合缓冲液的金属螯合层析管柱，以清洗缓冲液清洗管柱，接着以冲洗缓冲液冲洗出DAO‑6H蛋白。