[发明专利]一种体外扩增脐血NK的方法

摘要

一种体外扩增脐血NK的方法，它涉及一种扩增脐血NK的方法，本发明的目的是为了解决现有脐血NK扩增方法复杂，成本高，由于引入动物源成分，安全性不高，体外扩增时间长，细胞纯度低的问题，本发明通过加入多种细胞因子促进脐血NK细胞的增殖，增强NK细胞的活性。本发明操作简单，成本低，不引入动物源成分，安全性高。本发明培养15天即可收获脐血NK细胞，且细胞纯度为95.33％，细胞总数120亿/份脐血，对肺癌A549细胞杀伤效果较好。

主权项

1.一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于它的具体步骤如下：一、在T75培养瓶中按体积比为1:4的比例加入包被液和生理盐水；1mL包被液中包含成分：浓度为3～7μg/mL的CD16单抗、浓度为800～1200μg/mL的IFN‑γ和浓度为400～600IU/mL的GM‑CSF；摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用生理盐水洗瓶底一次，去除生理盐水，放置T75培养瓶备用；二、脐血中单个核细胞的激活A、单个核细胞的分离：将80～100mL的脐血分装于离心管中，在650g，室温条件下离心15min，去除上层浅黄色血浆后，加入与上层浅黄色血浆等体积的生理盐水，得稀释的脐血；另取离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释的脐血加入到淋巴细胞分离液中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层，然后在650g，室温条件下离心30min，去除部分上清后，吸取中间的白膜层至离心管中，然后加入等体积的生理盐水，于室温260g离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；其中，淋巴细胞分离液与稀释的脐血的体积比为15:45～50；B、单个核细胞的激活：将上一步去除上清后的沉淀按细胞密度为2.0×106个/mL接种于GT‑T551H3无血清培养基，并加入因子，形成混合液；将混合液置于步骤一包被后的T75培养瓶内，然后在温度为37℃、体积百分含量为5％的CO2饱和湿度的培养箱中培养1～5d；并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液；其中，因子由IL‑2、IL‑7、IL‑15和IL‑21混合而成；且混合液中IL‑2的浓度为400～600IU/mL，IL‑7的浓度为8～12ng/mL，IL‑15的浓度为80～120ng/mL，IL‑21的浓度为150～200ng/mL；此步骤所述的补液为含浓度为400～600IU/mL的IL‑2、浓度为8～12ng/mL的IL‑7、浓度为40～60ng/mL的IL‑15和浓度为80～120ng/mL的IL‑21的GT‑T551H3无血清培养基；三、脐血NK细胞的体外扩增在上一步培养5d后，每隔2d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液，扩增后，即完成所述的体外扩增脐血NK方法；此步骤所述的补液为含浓度为400～600IU/mL的IL‑2、浓度为8～12ng/mL的IL‑7、浓度为40～60ng/mL的IL‑15和浓度为80～120ng/mL的IL‑21的GT‑T551H3无血清培养基。