[发明专利]一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，属于基因工程技术领域；具体包括CD36基因敲除小鼠基因型鉴定、血小板cDNA的PCR扩增、TA克隆及蓝白斑筛选、细胞转染及G418筛选、流式鉴定、Western Blot鉴定、CD36基因敲除小鼠免疫、细胞融合及抗体制备、抗鼠CD36单克隆抗体鉴定、单抗纯化及蛋白银染鉴定十个步骤；该方法可获得可稳定分泌鼠源性抗鼠CD36 mAb的杂交瘤细胞株，该mAb可特异性结合小鼠血小板的CD36抗原，与人血小板的CD36抗原无交叉反应，可用于CD36抗体引起的FNAIT小鼠模型的治疗研究，即保证与CD36抗原的特异性结合，又避免异种免疫反应。

主权项

1.一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：（1）CD36基因敲除小鼠基因型鉴定：根据The Jackson Laboratory提供的信息，合成CD36基因敲除小鼠鉴定的引物，上游引物为：5’‑ TTGAAGTGCTGATCCTTTCAGA‑3’，下游引物为5’‑ TGTTTGTTTCACCACACTGGA‑3’，下游突变引物为5’‑ CGCCTTCTTGACGAGTTC‑3’，经94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，获得435bp长度的野生型和/或750bp长度的突变型小鼠CD36基因序列；（2）血小板cDNA的PCR扩增：根据GenBank中编码小鼠CD36的cDNA序列NM_007643.4设计特异性引物，上游引物为5’‑AGTGCTCTCCCTTGATTCTG ‑3’，下游引物为5’‑TTTTCCATTCTTGGATTTGCA‑3’，经95℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸2min，共32个循环，最后72℃延伸10min，获得1419bp长度的小鼠CD36基因序列；（3）TA克隆及蓝白斑筛选：CD36基因序列经胶纯化后，参照PcDNA3.1TM/V5‑His TOPO®TA Expression Kit操作说明进行TA克隆，并转化TOP10E.coli，经蓝白筛选获得阳性质粒，37℃摇菌16h后，提取质粒DNA进行测序分析；（4）细胞转染及G418筛选：获得序列与小鼠CD36参考序列一致的质粒DNA后，参照Effectene® Transfection试剂盒的操作说明转染HEK293T细胞，并采用G418进行筛选培养；（5）流式鉴定：收集小鼠血小板CD36转染的HEK293T细胞，分别与0.05 µg CD36单克隆抗体MCA2748或20ul阳性血清于4℃孵育30min，洗涤两遍后，加入FITC标记的Donkey anti‑Rat IgG 抗体，4℃避光孵育30min，洗涤两遍后上流式机分析；（6） Western Blot鉴定：CD36转染细胞的裂解液经SDS‑PAGE电泳后，转PVDF膜，与抗V5肽单克隆抗体反应，然后加入HRP标记Donkey anti‑mouseIgG抗体，ECL曝光显影；（7）CD36基因敲除小鼠免疫：采用0.5X107个小鼠CD36HEK293T转染细胞腹腔免疫CD36‑/‑小鼠，每周一次，免疫三次后，给与尾静脉转染细胞加强免疫，三天后检测免疫效价并备细胞融合使用；（8）细胞融合及抗体制备：摘取抗体效价高的已免疫雌鼠CD36‑/‑的脾脏，将脾细胞与SP2/0‑Ag14细胞在PEG作用下进行细胞融合，并采用HAT培养液进行筛选培养；采用流式细胞技术对杂交瘤细胞培养上清进行抗鼠CD36抗体检测，筛选可分泌IgG型抗鼠CD36抗体的杂交瘤细胞，经两次有限稀释培养，获得分泌单抗的杂交瘤细胞株；（9）抗鼠CD36单克隆抗体鉴定：以流式细胞术进行单抗滴度及特异性分析；并运用 Rapid Antibody Isotyping 试剂进行小鼠单抗亚型鉴定；（10）单抗纯化及蛋白银染鉴定：收集单克隆细胞株的细胞培养上清，并借助Protein G亲和层析柱分离纯化CD36单抗，透析处理后进行SDS‑PAGE电泳，经蛋白银染分析单抗的分子量。