[发明专利]一种元麦提取物的制备方法及其在细胞抗氧化方面的用途

摘要

本发明提供了一种元麦提取物的制备方法及其在抗氧化方面的用途，属于食品功能开发领域。以新鲜元麦为原料，用乙醇提取其中的活性物质，并通过有机试剂萃取、浓缩、真空冷冻干燥，制备元麦提取物；建立H₂O₂诱导细胞损伤模型，采用MTT法、试剂盒检测法发现，元麦提取物对氧化应激下的细胞存活率有显著提高，能够明显降低细胞中ROS水平，提高超氧化物歧化酶酶活、还原型谷胱甘肽含量，降低细胞外乳酸脱氢酶的释放量，在抗氧化方面的用途十分显著。本发明处理方式简单，深度利用元麦资源，以接近于体内生理状况的方式发明了元麦提取物在细胞抗氧化方面的作用；提取物为固体粉末，不仅易于运输，而且可作为辅料添加在食品中，应用范围十分广泛。

主权项

1.一种元麦提取物的制备方法及其在抗氧化方面的用途，其特征在于，以新鲜元麦为原料，从中提取、制备高活性物质，通过H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型，采用MTT的方法测定元麦提取物对细胞活力的保护作用；采用试剂盒检测的方法研究细胞ROS水平、细胞抗氧化酶酶活(如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、细胞中关键抗氧化剂含量(如还原型谷胱甘肽(GSH))、以及表征细胞膜完整性重要酶酶活(如乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH))的变化情况，发现了元麦提取物在细胞抗氧化方面的显著效果。具体方法如下：(1)元麦的预处理：称取颗粒饱满、洗净晾干的元麦仁，粉碎后过40‑80目筛，得到元麦粉末；(2)提取液的制备：称取元麦粉末，按照1∶10‑1∶20料液比(以元麦粉末质量倍数计)加入浓度为40‑80％乙醇‑水溶液(以乙醇‑水溶液体积百分比计)，充分搅拌混匀，在30‑50℃水浴条件下超声处理2‑8h，再以3000‑8000rpm/min条件离心5‑10min，重复提取2‑5次，收集上清为元麦提取液；(3)提取液的浓缩：将提取液装入体积合适的圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪，以80‑150rpm/min为转速，恒温25‑50℃为水浴条件进行蒸干，加入1‑5mL纯水，反复摇晃震荡烧瓶，使瓶底的残余物溶解，收集溶解后的液体为浓缩液；(4)提取液的萃取：在浓缩液中加入少量饱和食盐水，再按1∶1比例(以浓缩液体积倍数计)加入乙酸乙酯进行萃取，震荡摇匀、静止5‑15min，待完全分层，重复萃取3‑5次，收集上层萃取液；(5)提取物的制备：将萃取液置于旋转蒸发仪，以80‑150rpm/min为转速，恒温25‑50℃为水浴条件进行蒸干，加入1‑5mL纯水，反复摇晃震荡烧瓶，使瓶底的残余物溶解，收集液体于零下20‑80℃预冷24‑60h，再以零下40‑65℃条件真空冷冻干燥18‑60h，得到元麦提取物；(6)细胞的培养：取出保存于‑80℃液氮中的细胞冻存管，在37℃温水中轻轻摇动，将融化后的细胞冻存液移至离心管中，加入2‑5mL含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、1％1mol/L Heps缓冲液的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium‑high glucose(DMEM)培养基(分别以DMEM培养基体积浓度、体积浓度、体积百分比计，以Heps缓冲液体积浓度计)，1000rpm/min条件下离心3‑7min，舍弃上清液，之后加入5‑30mL含有20％胎牛血清的上述培养基(以加入血清后培养基体积百分比计)，吹打均匀，转移细胞悬液至底面积为25‑75cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积浓度计)进行培养；(7)细胞的传代：在步骤(6)培养瓶中加入2‑10mL胰蛋白酶，轻轻摇晃后放入步骤(6)恒温箱，消化贴壁细胞1‑5min，期间取出培养瓶，在物镜为10倍的显微镜下观察，直至细胞基本由贴壁条状或片状变为游离状即可，加入5‑15mL步骤(6)不含血清培养基终止反应，3000rpm/min离心5min后，在沉淀中加入5‑30mL步骤(6)含血清培养基，吹打成细胞悬液，转移至新培养瓶，待细胞长满至瓶底面积70‑90％时进行下一次传代；(8)细胞氧化损伤模型的建立：选取步骤(7)培养至3‑6代的细胞进行建模，向消化后的细胞沉淀中加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，浓度为1×105‑1×106个/mL(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24‑48h，之后待细胞长满至96孔板底部，加入终浓度为400‑2400μmol/L的H2O2‑水溶液(以H2O2‑水溶液体积浓度计)，培养2‑48h；(9)元麦提取物的保护作用：选取步骤(7)培养至3‑6代的细胞，制成1×105‑1×106个/mL单细胞悬液(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24‑48h，待细胞长满至96孔板底部，取出，加入终浓度为1‑20μg/mL的元麦提取物(以提取物溶液的体积浓度计)，培养时间6‑48h；(10)具有抗氧化活性食品的制备：将本发明的元麦提取物以一定比例直接加入液体饮料中，制成功能性饮料，也可以加入固体食品中，用于面包、面条、饼干、糖果、固体饮料等的制作。