[发明专利]一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法

摘要

本发明公开了一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，包括以下步骤：(1)特异性接头序列、特异性逆转录引物与检测探针和引物序列的设计；(2)接头连接：在RNA中加入步骤(1)中设计的特异性接头序列，经过变性、退火、连接三步形成特异性末端环状发夹结构；(3)步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合进行逆转录；(4)TaqMan qPCR检测。本发明基于TaqMan qPCR方法，为生物体内tRF的研究提供了一种有效且便捷的可精确分辨不同tRF变体的方法，分辨率可精确至单个核苷酸差异，这对于全面深入研究tRF的生物学功能和作用机制具有有重要意义。

主权项

1.一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据不同tRF序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’‑Db‑接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’‑Db‑接头与tRF3的5’末端相连接；同时设计特异性逆转录引物并在跨接头处设计用于TaqMan qPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；(2)连接接头：取RNA样品100‑1000ng与20pmol步骤(1)所述特异性接头序列混合，与退火缓冲液形成10μl体系，于95℃变性3分钟，自然降温2小时退火后使用T4 RNA连接酶于37℃孵育1小时，4℃连接过夜以形成稳定的末端发卡结构，从而得到接头RNA；(3)特异性逆转录引物的逆转录反应：使用逆转录试剂盒，将步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合配制逆转录体系，反应形成逆转录产物；(4)TaqMan qPCR检测：使用TaqMan qPCR试剂盒，在步骤(3)所述逆转录产物中加入步骤(1)所述TaqMan探针以及上下游扩增引物，混合配制qPCR扩增体系，采用相对定量法根据CT值计算目标tRF的表达量。