[发明专利]一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法

摘要

本发明公开了一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，包括以下步骤：S1：取样；S2：耐药细菌DNA提取预处理；S3：混匀冷却；S4：吸、弃上清；S5：洗涤溶解；S6：稀释样本；S7：PCR反应；S8：SAP反应；S9：延伸反应；S10：样本脱盐；S11：点样到芯片上；S12数据分析。本发明严格控制该基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，基于多基因耐药靶标检测有耗时短、准确性高的优点，该检测方法主要通过MassARRAY技术对耐药细菌的DNA进行快速检测，以9株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌进行全基因组测序分析，20个SNP位点使用MassARRAY进行一次性检测，单个SNP位点检测符合度达95％，通量高过Sanger测序，所检测的位点数和基因数是Sanger测序200倍，大大缩短了耐药细菌的基因检测时间。

主权项

1.一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：取样，取样9株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌为样品，备用；S2：耐药细菌DNA提取预处理，分别取耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌在1.5ml离心管中加入液氮预冷，并研磨均匀，加入650μl温度为60‑70℃预热的CTAB溶液中；S3：混匀冷却，将装有CTAB溶液和样品的离心管放入60‑70℃的水中温浴，温浴时间0.4‑0.6h，每15min混匀一次，冷却后，加入等体积的氯仿：异戊醇，混匀，转速为12000rpm条件下，离心14‑16min；S4：吸、弃上清，将S3中的液体样品，装入新EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇，转速为12000rpm，离心14‑16min，再转入新的离心管中，加入1/3体积的NaAc(3mol/L)，加入0.4‑0.6ml异丙醇，混匀后置于‑18～‑22℃，时间0.4‑0.6h，再将液体样品置于转速为12000rpm条件下，进行8‑12min弃上清处理；S5：洗涤溶解，向离心管中加入75％的乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干，再加入超纯水24‑26μl溶解，即获得DNA提取物，并置于‑18～‑22℃条件下保存，备用；S6：稀释样本，将S5中提取的样品稀释至总体积为28‑32μl的样品；S7：PCR反应，将样品按照每反应孔总体积为4‑6μl进行PCR反应扩增；S8：SAP反应，再加2μl SAP混液到每一个反应孔里，加混液后总体积7μl进行SAP反应扩增；S9：延伸反应，每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好，加混液后总体积9μl进行延伸反应扩增；S10：样本脱盐，把洁净树脂铺平在96/15mg dimple plate上，风干最少10min；S11：点样到芯片上，用点样仪将样本点到对应的SpectroCHIP芯片上；S12：数据分析，记录实验检测数据，并进行结果统计分析。