[发明专利]一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建

摘要

本发明提供了一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，主要包含以下步骤：(1)构建含有PyrG上下游的双元载体；(2)双元载体转化农杆菌AGL1；(3)在DPY培养基培养野生型米曲霉3.042，3天后洗下孢子；(4)孢子与含有目的载体的农杆菌共培养60小时；(5)共培养后的孢子转移到含有头孢，Ura/Uri和5‑FOA的CD培养基筛选；(6)筛选培养基生长出来的转化子单菌落进一步在不同培养基上培养，通过生长表型验证是否为PyrG营养缺陷型；(7)验证后的米曲霉提DNA，进一步PCR验证。本发明首次建立了由农杆菌介导的米曲霉PyrG基因敲除体系；较原来的诱变筛选或者原生质体介导的基因敲除体系减少工作量，提高了敲除效率，构建了一种营养缺陷型米曲霉，可以为其遗传操作奠定了基础。

主权项

1.一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于，由以下步骤组成：1)以米曲霉3.042基因组DNA为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增获得上游片段；以序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的DNA片段为引物执行PCR扩增获得下游片段；以上两种PCR产物为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的DNA片段为引物执行，PCR将PyrG基因基因上下游拼接到一起；将拼接好的上下游片段连接T载体，测序验证；验证正确后的T载体，通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将拼接好的片段连接双元载体pGreenⅡ，构建好的载体命名为PyrG‑pGreenⅡ；将PyrG‑pGreenⅡ转化农杆菌AGL1；2)米曲霉3.042孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子，孢子过滤，然后4000rpm离心10min，蒸馏水洗2次，调整浓度至：1*106个/ml，备用；3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1接种于10ml同时具有卡娜和利福平抗性的LB液体培养基中，以28℃的温度、200rmp的转速转摇瓶培养；取1ml培养液加9ml IM液体培养基混合，而后液置于28℃的问题，200rmp的转速，摇瓶培养6小时，得到菌液；4)取100μL步骤3)所得的菌液和100μL步骤2)所得的孢子悬液其浓度为1*106个/ml，混匀共涂到铺有玻璃纸IM固体培养基上，于22℃，避光培养60小时；5)将玻璃纸转移至筛选培养Ⅰ，然后玻璃纸覆盖一层筛选培养基Ⅱ，30℃培养5‑7天；挑取生长出培养基的菌斑至新的筛选培养基Ⅱ和CD培养基；正常米曲霉在CD培养基上可以生长而在筛选培养基不能生长，而PyrG营养缺陷型在CD培养基生长不能生长只能在筛选培养基上生长；6)挑取在筛选培养基可以生长而在正常CD培养基不能生长的转化子，于CD+Ura/Uri培养基培养，提取DNA，以序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的DNA片段为引物执行和SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7的DNA片段为引物执行扩增，检测ORF是否成功敲除。