[发明专利]一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明公开了一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法。一锅法滚环扩增将常规滚环扩增反应合三为一，将扩增需要的锁式探针、dNTPs等原料构成A溶液，所需的缓冲液，连接酶、聚合酶和目标序列混合构成B溶液，将溶液A和B溶液混合，在一定温度下和一定的缓冲体系下反应扩增所需要的时间。本发明建立了快速简便的一锅法滚环扩增新方法，提供一种简单快速、灵敏度高的单核苷酸多态性的方法，具有操作简便、分析时间短、特异性高、更适于原位检测的特点。

主权项

1.一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：（1）一锅法滚环扩增：将1μL浓度为1μmol/L的锁式探针、1μL浓度为10 mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物即dNTPs和8μL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水混合组成10 μL A预混液，再将2μL 10×Taq DNA 连接酶 Buffer、2μL10× Bst DNA 聚合酶Buffer、1μL浓度为10 nmol/L的待测靶序列、0.5μL 40U/μL的Taq DNA连接酶、0.5μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶以及4μL DEPC水混合组成10 μL B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，以上操作均在冰面上进行，然后至于55℃下反应6小时，于80℃下20分钟使酶失活以终止扩增反应；（2）单核苷酸多态性分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5μL、1μL 6×Loading Buffer和0.6μL 100×Syber GreenⅠ工作液，室温放置5分钟，灌胶后点样到质量浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1×TBE缓冲液，即0.04 mol/L Tris‑硼酸，0.001 mol/L EDTA，pH=8.0，在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片；（3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2 μL、2 μL 20×Syber GreenⅠ溶液，用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液pH7.4溶液稀释到100 μL，室温下保持10‑15分钟，用350 μL的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。